安徽大学微生物实验讲稿.doc

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1、微生物实验讲稿李能树安徽大学生命科学学院生物技术系二零零二年四月目 录 实验一 培养基的制备与灭菌3 实验二 从土壤中分离与纯化微生物8 实验三 细菌的单染色和革兰氏染色11 实验四 细菌的芽孢和荚膜染色法14 实验五 放线菌、霉菌、酵母菌的形态观察16 实验六 微生物的直接计数法和大小测定19 实验七 微生物的生理生化反应22 实验八 多管发酵法测定水中大肠菌群28 实验九 大肠杆菌生长曲线的测定32 附录 培养基34 附录 染色液37实验一 培养基的制备与灭菌一、目的： 1、学习一般培养基的制备方法； 2、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用的灭菌方法。二、原理 1、培养基：培养基是按照微生

2、物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工的方法配制而成的一种基质。它是微生物的生活环境，各种微生物对养分和培养基的物理、化学条件要求不一样，为了分离、培养、鉴定、保存和研究不同种类的微生物，就应当根据它们的需要，配制合适的培养基。微生物在培养基上生长、发育，必须在一定的最适酸碱度范围才能表现出它们最好的生命活动。不同的微生物对对酸碱度的要求不同，因此，我们在配制培养基时，必须调节培养基的pH值。 培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基： 天然培养基：主要成分是复杂的天然有机物质，如马铃薯、玉米粉、豆饼粉、

3、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，这些复杂天然有机物质的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的数量也不恒定的天然有机物质配制成的培养基，如：牛肉膏蛋白胨、马铃薯、麦芽汁培养基。适用于生产上大规模培养微生物。 合成培养基：合成培养基是用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基，也称化学成分明确的培养基（chemically defined medium），高氏一号培养基、查氏培养基等。一般适用于在实验室范围内研究微生物的形态、营养代谢、分类鉴定、生物测定、菌种选育和遗传分析等工作。 半合成培养基：在以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基叫半合

4、成培养基。大多数微生物都能在此种培养基上生长，应用广泛，如，马铃薯葡萄糖培养基，很多霉菌都生长良好。 固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基，常用凝固剂有琼脂、明胶、硅胶，硅胶用于配制自养微生物的固体培养基；对于其他多数微生物来讲，琼脂最为合适，一般加入1.52.5%即可凝固成固体，如牛肉膏蛋白胨培养基等。此培养基可供微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等。 半固体培养基：在液体培养基中加入少量凝固剂即配成为半固体培养基，如，加入0.20.7%琼脂作为凝固剂。用来观察细菌运动特征、鉴定菌种、菌种保藏和噬菌体的效价滴定等。 液体培养基：不加任何凝固剂配好后成为液体状态的培养基。如，

5、糖发酵液体培养基、蛋白胨水培养基等。常用于大规模的工业发酵生产、遗传学研究、生理代谢等基本理论的研究工作。 根据培养基的特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基： 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质，常用的基础培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，也是作为某些特殊培养基的基础成分。 加富培养基：是在基础培养基中加入血、血清、动物组织提取液或植物组织提取液，主要用于对培养某些微生物要求比较苛刻的营养。 选择培养基：是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学条件的抗性而设计的培养基。一种是根据某些微生物对碳、氮源等营养的特殊要求所设计的选择性培养基，就可以

6、分离到能分解某些物质的微生物。如以纤维素作唯一碳源的选择性培养基，可以分离到分解纤维素微生物；无氮培养基可以分离到固氮微生物。另一种是根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性而设计的培养基，最常用的是在培养基中加入某些化学物质，以抑制不需要的微生物的生长繁殖。如在分离放线菌时，在培养基中添加10%的酚数滴可抑制细菌和霉菌的生长，又如分离霉菌的马丁氏（Martun）培养基。 鉴别培养基：是在基础培养基中加入某种化合物或化学试剂，某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与某种化合物或化学试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与其他种微生物区别开来，如糖发酵

7、培养基、尹红美蓝培养基等。 2、灭菌： 消毒与灭菌两者有不同的概念。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，而不能杀死全部芽孢，因此，消毒只是一种常用的卫生措施；灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子，因此，灭菌后的物品是无菌的。灭菌的方法很多，有加热、过滤、照射和化学药品等。 加热法：又分干热灭菌和湿热灭菌两种。 a干热灭菌：有火焰烧灼和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具（如镊子）等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上短暂烧灼灭菌。通常所说的干热灭菌是在电热干燥箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿（如吸管和培养皿）等的灭菌，在热空气1601700C下保温2小时进

8、行灭菌。b湿热灭菌：高压蒸汽灭菌发 此法时将物品放在高压蒸汽灭菌锅内1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分钟进行灭菌，时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以到达彻底灭菌为准。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌。间歇灭菌法 有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用于干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热1000C，30分钟，连续3天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物去出放室温下1824小时，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加

9、热1000C，30分钟，发育的营养体有被杀死，但可能仍有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间1015分钟，人用注射器和手术器械在有条件的地方，一般均采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法灭菌。表 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含量/%30分钟内凝固所需的温度/505625748018809061450160170表 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系压力数全部空气排2/3空气排l/2空气排l/3空气排空气全不排MPaKg/cm2Ib/in2出时的温度/出时的温度/出时的温度/出时的温度/出时的温度/0.030.

10、070.100.140.170.210.350.701.051.401.752.1051015202530108.8115.6121_3126.2130.0l34.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121现在法定压力单位已不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：lkg/cm2=98066.5Pa；lIb/in2=6894.76Pa。表 干热湿热穿透力及灭菌效果比较温度/时间/h透过布层的温度/灭菌20层10层100层干热130-140湿热105.34386101721017

11、0.5101不完全完全 过滤除菌；紫外线灭菌；化学药品灭菌等 三、材料： 1、药品：Nacl 蛋白胨 牛肉膏 可溶性淀粉 K2HPO4 Hcl NaOH 琼脂 葡萄糖 蔗糖 NaSO4 黄豆芽 马铃薯等。 2、器材：台秤 三角瓶 试管 漏斗 电炉 搪瓷杯（铝锅） 试管架 玻棒 滴管 称量纸 pH试纸 棉花 纱布 牛皮纸 棉线 灭菌锅 干燥箱等。 四、方法及步骤： 1、一般培养基的配制：称量：按照培养基配方，称取各种成分；熔化：在容器中先加入所需蒸馏水水量的一部分，依次将各成分加入，使全部溶解，最后补足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物质配制培养基时，需加热溶解，并补足因蒸发而减少的水分。配制固体培养

12、基时，先将上述配好的液体培养基加热到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热到琼脂完全溶化，在加热溶解过程中要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢。矫正pH值：初配制好的培养基，往往不能符合所需求的pH值，故必须矫正，用精密pH试纸，以1NHCl或1NnaOH调节至所需要的pH值。过滤：用滤纸、棉花或双层纱布过滤。分状：根据不同的需要，可将制成的培养基分装于三角瓶或试管内，分装时取玻璃漏斗一只，装在漏斗架上，漏斗下连接橡皮管与一根玻璃管相接，橡皮管上夹一只弹簧夹，将培养基到入漏斗内，用左手拿空试管的中部，并将漏斗下玻璃管插入试管内，以右手拇指和食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管上端

13、，使培养基流入管内（见图）。注意不要使培养基沾污上段管壁及管口，保持棉塞的干净。分装量根据试管大小和实际需要而定。制备试管斜面培养基时，每支的分装量约为管高1/5左右为度，液体培养基分装试管的量以管高的1/4左右为宜，三角瓶的分装量，不宜超过三角瓶的一半。棉塞的制作与灭菌：棉塞要做的形状、大小、松紧完全合适，紧贴管壁不留缝隙，正常的棉塞，头稍大些，约有2/5在外，3/5在试管内（见图1），塞好棉塞后，用牛皮纸包扎，置高压蒸汽灭菌锅中灭菌。斜面培养基的制作：固体培养基经灭菌后，如果要做成斜面，则在取出试管后略为冷却，而后放置桌上，管口端放在木条上或其他支持物上，使其倾斜，倾斜度以培养基正好形成斜

14、面为准（见图2）。无菌试验：培养基经灭菌后，必须先放进370C恒温箱内，经24小时后，若无微生物生长才能使用。 2、灭菌： 灭菌是微生物生产和实验的基本技术，其方法很多，因灭菌对象及设备条件不同而适当选用。下面分别介绍几种常用的灭菌方法。 干热灭菌：这种灭菌法是利用热空气使物体升温，而导致物体上所带的微生物由于干热脱水而死亡。常用于空玻璃器皿、金属用具等的灭菌，对于带胶皮的物品、液体及固体培养基等不能使用此法灭菌。 使用步骤： 将要灭菌的器皿（培养皿、吸管等）包扎好，放入恒温干燥箱内。 接通电源，打开开关；旋动恒温调节器至1600C，当达到此温度时，借助恒温调节器的自动控制，保持恒温两小时。两

15、小时后，关掉电源，当温度降至与室温差不多时，打开箱门，去出灭菌物品，并将调节器旋转到“0”。注意事项： 灭菌的器皿必须干燥，否则容易破裂。 灭菌的温度不能超过1800C，否则棉花、报纸、牛皮纸要烧焦，甚至发生事故，所以在使用时，要随时检查温度情况，以防自动恒温调节器失灵。 灭菌后，假如温度没下降就打开箱门，冷空气突然进入箱内，玻璃器皿就要破裂；同时，热空气冲出，有灼伤皮肤的可能。因此，必须在温度降至与室温差不多时方可开箱门。 2、高压蒸汽灭菌： 此种灭菌方法的原理是在一密闭容器中，煮沸时形成的蒸汽不能扩散到容器外面去，而堆积在密闭的容器内，使蒸汽压力升高；随着水的煮沸，温度也就相应增高。利用过

16、热的蒸汽来使细菌及其耐热芽孢蛋白质凝固变性，以致失去生命力，从而达到彻底灭菌的效果。 高压蒸汽灭菌是最有效的灭菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分钟进行灭菌，就可杀死一切微生物细胞及其芽孢或孢子。进行高压蒸汽灭菌的仪器叫高压蒸汽灭菌锅。灭菌对象是培养基、玻璃器皿和各种不因高温处理而变质的物品材料。但对一些不耐高温、高压的溶液或培养基不宜用此种方法。 锅内加入适量的水，使水面与三脚搁架相平为宜。 打开灭菌锅盖，把要灭菌的材料装入锅内，注意不要放得太挤，防碍蒸汽流通，影响灭菌效果。 盖好灭菌锅锅盖，按对角线形式均匀拧紧锅盖上的螺栓，螺栓松紧一致，切勿漏

17、气。 打开排汽开关，以排除锅内的冷空气。 打开电源，排除冷空气。水沸腾后，灭菌锅内就逐渐充满蒸汽，并将冷空气排出，待冷空气完全排尽后，关闭排汽开关。让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时。控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分钟。 灭菌所需时间到后，关闭热源。 让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至“0”时，打开排汽开关。 打开灭菌锅盖，去出已灭菌的物品及培养基。 将取出的灭菌培养基放入370C恒温箱中培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可使用。 注意事项：如果压力未降到“0”时，打开排汽阀，就会因锅内压力

18、突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。 3、间隙灭菌： 有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用于干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热1000C，30分钟，连续3天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物去出放室温下1824小时，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热1000C，30分钟，发育的营养体有被杀死，但可能仍有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。 4、紫外线灭菌： 紫外线是一种强杀菌剂，其波长在20003000之间都具有杀菌

19、作用，其中以25002800者杀菌力最强。它的杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成o，再使O2氧化成臭氧(O3)或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）,O3和H2O2均有杀菌作用。它的杀菌作用随剂量的增加而增加，不同微生物对紫外线的敏感性是不同的。一般细菌经紫外线照射510分钟，即可死亡。接种室和接种箱常紫外线灯光作空气灭菌。由于紫外线穿透力不强，故一般只适用于物体表面和环境的灭菌。为了加强紫外线的灭菌效果，在开灯以前，可以在接种室内喷雾苯酚溶液。室内的桌面和坐凳可用0.1%新洁尔灭溶液擦洗，然后再开紫外线灯光照射

20、2050%分钟（视接种室大小而定），以杀死空气中各种微生物细胞及芽孢为原则，必要时，可做无菌检查。 5微孔滤膜过滤除菌(1)组装、灭菌将0.22m孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用（0.1 MPa，121.5灭菌20min）。(2)连接将灭菌滤器的人口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。见图-5。(3)压滤将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拔出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。(4)无菌检查无菌操作吸取除菌滤液0.1mL于肉汤蛋白

21、胨平板上，涂布均匀，置37温室中培养24h，检查是否有菌生长。(5)清洗弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经灭菌后使用。整个过程应在无菌条件下严格无菌操作，以防污染。过滤时应避免各连接处出现渗透现象。 五实验报告：思考题：1.为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？请设计干热灭菌与湿热灭菌效果比较实验方案。2.高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内的冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？3.细菌营养体和细菌芽孢对紫外线的抵抗力一样吗？为什么？4.过滤除菌应注意哪些问题？六.实验建议1.使用灭菌锅应严格

22、按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开；务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。2.干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触，以防包装纸烤焦起火。3.过滤除菌时应注意检查过滤装置各连接处是否漏气，以防污染。 七预习： 实验二、土壤微生物的分离与纯化。实验二、从土壤中分离与纯化微生物 一、实验目的： 1、了解纯种分离的原理及其生产实践中的应用； 2、学习并掌握各种无菌操作技术，巩固无菌概念； 3、学习微生物的接种、分离和纯化的基本方法以及平板菌落计数法。 二、原理： 在自然界里，微生物的种类繁多，数量很大，几乎都是杂

23、居在一起的，为了适应工、农、医发展的需要，常常从自然界中分离，以获得新的种。土壤是微生物的大本营，在土壤物质转化中具有多种重要作用，它与土壤肥力和植物营养有密切关系，同时又是工业和医药用菌的资源。纯种分离是从含有很多种微生物的自然材料中，通过稀释分离、划线分离、单细胞分离等方法，使它由单个的个体在固体培养基上繁殖形成单个菌落，由于此菌落是由一个个体繁殖而来的，故可获得了纯种。这种获得单个菌株纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据某种微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给他们适宜的生活条件或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境从而

24、淘汰其他杂菌，通常可以通过平板稀释分离法平板划线分离法，使它们在固体培养基上形成单个菌落，从而得到纯菌株。 接种是微生物生产好外和科学实验中一项最基本的操作技术，接种的关键在于严格的无菌操作，如果操作不慎，引起污染，就会使得实验或科学研究的结果毫无意义，也会使得工农业生产遭受巨大损失，所以我们要特别强调无菌操作，树立牢固的无菌概念。 三、材料： 1、培养基：细菌培养基、高氏培养基、PDA培养基、豆芽汁培养基。 2、土壤样品。 3、器材：无菌培养基、无菌吸管、无菌纸、台秤、酒精灯、接种针、90ml带玻璃珠三角瓶、9ml试管的无菌水等。 四、方法： （一）、样品采集和处理： 1、样品（土壤）的采集

25、：采集土壤样品时，应先铲去23cm厚的表面土层，然后采集地表下520cm范围内的土壤100克左右，装入无菌袋内，并记录采集地点、日期、土壤的pH值，植被、土色、土壤肥力、气温及采集地点的高度等。 2、土壤的处理：将采集的土壤充分混合，取少量土壤在研钵中研细，然后放在灭过菌的试管中备用。 （二）、土壤分离的具体步骤： 1、用无菌纸迅速称取10克土壤，以无菌操作方法立即倒入盛有90ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡20分钟左右，这样样品与水充分混合，作成土壤悬液（即10-1），静置半分钟，吸取上清液。 2、取1ml无菌吸管一支，以无菌操作吸取10-1的土壤稀释液1ml到盛有9ml无菌水的试管内，即

26、成10-2的土壤稀释液（注意切勿使吸管碰到无菌水）。 3、更换一支无菌吸管在试管内反复吸上吹下数次，在吸1ml移至下一支试管中。依同法按每级稀释10倍的顺序共稀释六次（见图）。 4、每种稀释度（即10-5、10-6号试管）的土壤稀释液做2个牛肉膏蛋白胨琼脂平板、2个高氏一号琼脂平板、2个马铃薯蔗糖琼脂平板、2个豆芽汁葡萄糖琼脂平板和每种培养基做2个空白。 5、取无菌培养皿，在培养皿边注明稀释度、培养基、日期和姓名。 6、按无菌操作分别吸取每种稀释度（5、6号试管）的土壤稀释液1ml放入注明稀释度的培养皿内，然后将溶化好的四种培养基冷却至450C左右，分别倒入培养皿内，迅速旋转培养皿使其混匀，待

27、凝。 7、将分离细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）的培养皿置于（倒置）300C恒温箱中，培养24小时；分离的放线菌（高氏一号培养基）培养皿置于（倒置）280C恒温箱中培养7天；分离的霉菌（马铃薯培养基）培养皿置于（倒置）280C恒温箱中培养4天；分离的酵母菌（豆芽汁培养基）的培养皿置于（倒置）280C恒温箱中培养48小时。 8、将平板上分离得到的细菌、放线菌、霉菌、酵母菌的单个稀疏的菌落，描述后用琼脂平板划线分离法进一步的纯化或直接移到斜面上培养。 （三）、琼脂平板划线分离法： 1、平板的制备： 熔化琼脂培养基，待冷却至450C左右，取一无菌培养皿，把要打开的一边通过火焰，然后将培养皿置于实验台上。

28、取装有培养基的三角瓶，转动棉塞，用左手小指和无名指夹取棉塞，瓶口在火焰上灭菌。 左手将培养皿盖打开少许（示范），注入三角瓶中的培养基，使其厚度约为34mm，加盖后轻轻旋转培养皿，使培养基均匀分布、平置、凝固后即成平板。 2、按无菌操作方法用接种环先划A区（约划35条线），划好后，迅速盖好皿盖，并将接种环在火焰上灭菌，然后再划B区，最后划C区（见图），划完后，将接种环灭菌，置原处。 3、将培养皿置恒温箱中培养，按时观察生长情况。 4、将平板上获得的较良好的单个菌落，移种到斜面培养基上培养，即得纯种。 三、微生物菌落计数（平板菌落计数法）： 土壤中的微生物经稀释倾注培养后，每一个活菌细胞可以在平板

29、上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可根据平板上菌落的数目推算出每克土壤中所含的活菌总数，计算公式如下： 每克土壤微生物的数量=平均菌落树稀释倍数土壤克数一般有23个稀释度计算出的每克土壤的总菌数和同一稀释度出现的菌落均应很接近，如相差数目较大，表示操作不精确。 四、平板菌落及个体形态观察： 从不同平板上选择不同类型的菌落进行肉眼观察，区分细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的菌落形态特征。用接种环桃菌，视其与培养基结合紧密程度，再用挑取不同菌落制片、染色，在显微镜下观察其个体形态。 五、结果及报告： 将平板菌落计数结果填入表中每克土壤平均微生物数微生物不同稀释度菌落数每克土壤含微生物数平均每克土微生物细

30、菌放线菌霉 菌酵母菌实验三：细菌的单染色和革兰氏染色 一、实验目的： 1、学习微生物涂片、染色的操作技术、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法； 2、初步掌握无菌操作技术； 3、学习并掌握油镜的原理和使用方法。 二、原理： (一)油镜：利用显微镜观察菌体时，总希望能看见最细小的部分，即分辨率要高。显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力，主要是由接物镜来决定的，它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，显微镜的分辨力越大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出，所以，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分

31、辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了，显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的： 能辨别两点之间最小距离=/2NA 式中 =光波波长 NA=数值孔径 我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55m，假如数值孔径为0.65高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0.42m。而在0.42m以下的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的最小距离=0.55/21.25=0.22m。 因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍镜（NA=0.6

32、5）和放大率为24*的目镜，虽然总放大率为960*，但其分辨的最小距离只有0.42m，假如采用放大率为100*的油镜（NA=1.25）和放大率为9*的目镜，虽然总的放大率为900*，但却能分辨出0.22m间的距离。 微生物学研究用的显微镜的物镜有低倍镜10（16mm）、高倍镜（4mm）和油镜100（1.8mm）。油镜常标有红圈或黑圈，也有以“Ol(oilimmersion)”字样表示。 使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是一层油质，称为油浸系。这种有常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1.25，与玻璃相同，当光线通过玻片后，可直接通过香柏油进入物镜发生折射，如果玻片

33、与物镜之间的介质为空气，称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线虽然减少，这样就减低了视野的照明度。 利用油镜不但能增加照明度，更重要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大率能由其数值孔径决定的，所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用公式表示。NA=n.sin。式中NA=数值孔径、n=介质折射率、=最大入射角的半数，即镜口角的一半数。 所以，光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，的理论限度为900，sin900=1,故以空气介质时（n=1），数值孔径不能

34、超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，数值孔径也增大。如当光线入射角为1200，其半数的正弦为sin600=0.87。 以空气为介质时 NA=10.87=0.87； 以水为介质时 NA=1.330.87=1.15; 以香柏油为介质时 NA=1.520.87=1.32。 （二）、单染色： 由于细菌微小，无色透明，未经染色往往不易被识别，因此只有借助于染色法可使细菌着色，与背景形成鲜明对比，便容易在显微镜下观察。 细菌的单染色的原理一般认为是微生物与各种不同性质的染料具有亲和力而被着色。由于细菌的等电点较低，pH25之间，故在近于中性的环境中，细菌多带阴电，易于阳性的碱性染料结合而着色，因此细菌染

35、色我们一般都用碱性苯胺染料如美蓝、碱性复红、结晶紫、沙黄、孔雀绿等。 单染色是一种染料使所有细胞都染上相同的颜色，此法简便，适用于菌体一般形态的观察，但不能鉴别细菌，它是染色的基础，可以观察细菌的大小。 （三）、革兰氏染色： 革兰氏染色法是细菌学中一种重要的鉴别性染色方法，是1884年有丹麦医生Gram创立的，延用至今的经典染色法，经过革兰氏染色法后可以把全部细菌分为G+和G-两大类，鉴定细菌时首先要使用革兰氏染色法。关于它机制众说不一，以前有很多解释，当前认为与细胞壁的结构和组成有很大关系。革兰氏染色阳性细菌肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留

36、在细胞内而不被脱色，复染后不着色，不留结晶紫的颜色；而革兰氏染色阴性细菌肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙醇处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精将结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成红色，所有本实验的成败关键是酒精脱色，脱色不够将革兰氏染色阴性转变为革兰氏染色阳性，脱色过度将革兰氏染色阳性变成革兰氏染色阴性。其次涂片要均匀、薄；再者菌龄也可影响染色性，菌龄老，陈旧的细菌培养物，往往G+转变成G-，一般做革兰氏染色用18小时左右的细菌培养物，不要超过24小时，以免影响染色性。细 胞 壁 G+ G-厚度与强度厚、致密、坚

37、韧薄、疏松肽聚糖数量、含量多层、含量高、占细胞干重4090%单层、含量低、占细胞干重510%脂类含量少、占细胞干重14%多、占细胞干重1122%磷壁酸（垣酸） + 外壁酸（脂多糖、磷酸、脂蛋白） + 三、材料： 1、菌种：金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌； 2、染色液：革兰氏染色液、吕氏美蓝、石炭酸复红、生理盐水、香柏油等； 3、器材：显微镜、酒精灯、接种针、擦镜纸。 四、操作步骤： 1、单染色：涂片 自然 干燥 通过火焰23次 固定 12分钟 染色 洗水 水洗 自然干燥或洗水纸吸干 干燥 镜检 2、革兰氏染色：涂片 干燥 固定 1分钟 结晶紫 细水 水洗 媒染1分钟 碘液 水洗 脱色 95

38、%酒精 水洗 12分钟 蕃红溶液（复染） 水洗 镜检。 五、结果： 六、示范： 1、油镜的操作 2、无菌操作（涂片及染色步骤）。 无菌操作技术：无菌操作技术是微生物学实验中重要的方面。所谓无菌操作技术，是防止微生物进入人体或其他物体造成污染的操作技术。例如，医院在进行外科手术时，器械、手术室的灭菌就是防止微生物进入伤口造成感染。 微生物微小，无孔不入，在自然界的各个角落到处都有，空气、人的体表、口腔、食道等都有微生物存在，所以在实验时应严格进行无菌操作技术，防止杂菌污染。微生物实验的成败与无菌操作有密切的关系。 七、作业： 1、绘图（单染色和革兰氏染色的形态）； 2、思考题：P28(13) P

39、（16）； 八、预习：实验四 细菌的芽孢和荚膜染色法实验四 细菌的芽孢和荚膜染色法 一、实验目的： 1、继续学习微生物标本的制作方法； 2、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法。 二、原理： 芽孢、荚膜染色法都是利用细菌 各部位（分）的构造不同，它们对染料的亲和力也不同。因此，可以采用各种特殊染色方法，使细菌细胞的不同构造能在显微镜下显示出来，便于观察和区别。 三、材料： 1、菌种：枯草杆菌、甲细菌； 2、染色液：孔雀绿、蕃红溶液、碳素墨水、甲醇、生理盐水等； 3、器材：试管夹、酒精灯、接种针、载玻片、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸等。 四、方法及步骤： 1、芽孢染色法：某些细菌（革兰氏染色阳性

40、杆菌）生长到一定时间（对数期后期），在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的结构，这种结构称为芽孢，由于在细胞内也叫内生孢子。芽孢的特点是不能繁殖，休眠体，含水少、含脂高、不透明，对外界环境有很强的抵抗能力，有的芽孢在一定条件下可保持活力数年甚至数十年之久，芽孢尤其能耐高温，像枯草杆菌的芽孢，在沸水中可存活1小时，破伤风芽孢杆菌可存活3小时，而肉毒梭状芽孢杆菌的芽孢可忍受6小时，即使在1800C干燥箱中仍可存活10分钟，这主要是2.6吡啶二羧酸与钙的复合物占芽孢干重515%的原理。 芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环

41、节，它还是检验培养基灭菌彻底不彻底的依据。 芽孢染色的原理是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。细菌的芽孢壁比营养细胞的细胞壁厚，致密、透性低，着色和脱色都比营养细胞困难。因此，一般采用一种碱性染料（孔雀绿）并在微火上加热或延长染色时间。我们采用加热的方法，使菌体和芽孢同时都染上色后，再用水冲洗脱去菌体的染料，此时仍保留芽孢的颜色，并用对照染料来染菌体，这样就将芽孢和菌体分别染成两种不同的颜色。其步骤如下： 取枯草杆菌制成涂片、干燥、固定； 用试管夹夹住玻片的一端，在涂片上滴加孔雀绿34滴； 加热5分钟使冒蒸汽，切勿煮干； 冷

42、却、水洗（细水）； 蕃红溶液复染23分钟，水洗； 干燥、镜检； 结果：芽孢呈绿色，菌体呈红色。 菌体（红色） 芽孢（绿色） 枯草杆菌（12.5100#） 2、荚膜染色法： 有些细菌生活在一定营养条件下，可向细胞壁表面分泌一层松散透明、疏松、柔软、粘度极大，粘液状或胶质状的物质即为荚膜。 荚膜的化学成分，主要是多糖、多肽、蛋白质、脂以及由它们组成的复合物脂多糖、脂蛋白等。 荚膜虽不是细胞的主要结构，但它是细胞外碳源和能源性贮藏物质，并能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加默某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬细胞的吞噬。 产荚膜细菌 ，常常给生产带来麻烦，食品工业中的粘性面包，粘性牛奶，都是由于

43、染了此类细菌引起的，对制糖工业威胁更大，由于产荚膜细菌的大量繁殖，增加了糖液粘度，影响了过滤速度，使生产蒙受损失。但在一定条件下，有害的东西可变为有益的物质，如肠膜明串珠菌，在人为控制下，让其利用蔗糖合成大量产荚膜物质葡聚糖。葡聚糖是生产右旋糖酐的原料，而右旋糖酐是带代血浆的主要成分，具有维持血液渗透压和增加血溶量的作用，临床上还用于抗休克、消肿和解毒，所以在医学上十分重要。荚膜比菌体要大。 其染色原理是荚膜包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，它是由多糖类衍生物、糖原或多肽所聚积而成，此层对染料结合力很弱，因此不易染色，故一般采用负染色的方法，使细菌和背景着色，背景与菌体之间形成一透明区即荚膜，便于观察，由于荚膜很薄，容易变形，在制片是一般不用加热固定。其步骤如下：