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1、实验一实验基础知识/基本技能培训,实验基础知识/基本技能培训,实验目的 谨记实验室规程认识分子生物学实验的主要仪器设备掌握分子生物学实验仪器设备基本技能,目 录,前言：分子生物学实验规程第一节：分子生物学实验设备第二节：分子生物学基本技术第三节：实验安排,前 言分子生物学实验规程,实验规程,严格遵守生命科学中心制定的安全规则。发现实验室/楼内任何地方有危害安全之人、事、物等，必须立即向有关人员反映并作紧急处理。1)穿着规定必须按规定穿戴工作服。进行危害物质、挥发性有机溶机、特定化学物质等化学药品操作实验，必须要穿戴防护具（防护口罩、防护手套、防护眼镜）。长发及松散衣服妥善固定。,实验规程,2)
2、饮食规定禁止在实验室吃喝食物且使用化学药品后需先洗净双手方能进食。严禁在实验室内吃口香糖。禁止使用实验室仪器冷藏/加热食物。,实验规程,3)药品操作相关规定：操作危险性药品请务必遵守操作守则或遵照老师操作流程进行实验，勿自行更换实验流程。识记清楚药品危害性，避免危害发生。,实验规程,4)用电安全相关规定：按照规定（电压、功率）合理用电。手上有水或潮湿请勿接触电器用品或电器设备。掌握主要仪器、设备的性能和操作方法，严格按操作规程操作。最后离开实验室务必随手将不用的水、电等开关关闭。,如：擦拭、维修过程中要关闭电源,实验规程,5)环境卫生相关规定：注重环境卫生，并须保持整洁。化学物溢满地面或工作台
3、时应立即选用合适的方法擦拭冲洗干净。严格区分开污染区和洁净区。,污染区：戴手套操作。洁净区：徒手操作。,实验要求,1)详细记录和分析实验结果，并按时提交实验报告；2)实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么；3)仔细操作和观察；4)保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉。,第一节分子生物学实验设备,分子生物学实验设备,1)温度控制系统2)实验用水处理系统3)消毒系统4)计量系统5)离心设备6)电泳装置7)凝胶成像系统8)PCR仪9)生物培养设施10)蛋白质检测设备11)其他设备,温度控制系统,环境温控：大部分的分子生物学实验都要求在一定的温度下进行操作，为了保持这些条件，实验室应
4、装备空调等。药品、试剂、样品等的保存：不同药品、试剂、样品要求在不同的温度下保存，实验室必须备有4、20、80的冰柜/箱，需要在更低温度下保存的样品，则须使用液氮罐。,药品、试剂、样品等的取放,温度控制系统,低温操作可以用制冰机制冰块降温；对于需在较高温度下进行的操作，则可使用烘箱、微波炉、恒温水浴锅、恒温空气摇床等。,实验用水 一次蒸馏水：水经过一次蒸馏，不挥发的组分残留在容器中被除去，挥发的组分（氨、二氧化碳、有机物）进入蒸馏水的初始馏分中，通常只收集馏分的中间部分，约占60。多次蒸馏水：在一次蒸馏水中加入碱性高锰酸钾溶液，除去有机物和二氧化碳；加入非挥发性的酸（硫酸或磷酸），使氨成为不挥
5、发的铵盐。无（去）离子水：指除去了呈离子形式杂质后的纯水。主要指采用离子交换树脂处理方法，应用离子交换树脂去除水中的阴离子和阳离子，但水中仍然存在可溶性的有机物。,实验用水处理系统,实验用水 超纯水：既将水中的导电介质几乎完全去除，又将水中不离解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水。超纯水中除了水分子(H20)外，几乎没有什么杂质。各种用水，在贮存中都会被污染：塑料容器会产生有紫外吸收的有机物；玻璃和金属容器会产生金属离子的污染；长时间放置更会使水长菌，空气中CO2会溶入水中。所以贮存一定要隔绝空气，密封盖严，必要时贮存在冰箱的冷藏室中；最好使用“新鲜的水”。,实验用水处理系统,分子生
6、物学实验用水 普通蒸馏水、二次蒸馏水、无/去离子水、超纯水。,实验用水处理系统,常用的灭菌方法：高温、高压灭菌、紫外线照射、火焰焚烧、过滤除菌、酒精等试剂浸泡消毒等，因此实验室必须配备各种无菌处理设备。常用的灭菌仪器设备：高压灭菌锅、紫外灯、酒精灯、滤膜等。,消毒系统,常用的定量系统有：称量系统、液体体积度量系统、pH测定系统、液体溶质定量系统等。称量仪器：最常用的是电子天平。酸碱度pH测量仪器：最常用的是pH试纸和pH计。,计量系统,液体体积度量仪器：常用的有各种量筒、移液管、容量瓶、移液器。,计量系统,液体溶质定量仪器：主要有紫外分光光度计和可见分光光度计等。,计量系统,实验用离心机分为制
7、备性离心机和分析性离心机。制备性离心机主要用于分离各种生物材料。离心方法是分离和制备生物大分子最常用的手段。制备性离心机可分为三类:低速、高速（冷冻）、超速离心机。,离心设备,电泳是生化实验中最常用最重要的实验技术之一，主要用于分析、鉴定，也可用于制备。电泳装置由电泳仪和电泳槽两部分组成。电泳仪：电泳时提供一定的电压和电流 电泳槽：凝胶电泳系统的核心部分，根据电泳的原理，凝胶都是放在两个缓冲腔之间，电场通过凝胶连接两个缓冲腔。,电泳装置,电泳槽：核酸或蛋白质的电泳定性/定量分析时的凝胶支架。电泳槽又分为水平电泳槽和垂直电泳槽。,电泳装置,是分子生物学实验中的重要观测仪器，几乎全部的实验结果都需
8、要经由凝胶成像系统来观察。可用于观察分析各种透明或不透明的电泳图像，包括琼脂糖凝胶电泳检测DNA结果的观察、PCR产物的检测观察，垂直板凝胶电泳检测基因多态性的银染胶、蛋白胶、斑点印迹（RNA/蛋白质检测）结果的观察等。,凝胶成像系统,紫外分析仪,用于检测许多主要生物大分子物质如蛋白质、核苷酸等。,PCR(Polymerase Chain Reaction)是指聚合酶链式反应。其反应是用DNA聚合酶在体外大量扩增DNA片段的一种方法。PCR仪就是将此方法实现了自动化操作的一种仪器，是分子生物学实验常用和必备的设备。PCR仪包括普通PCR仪、梯度PCR仪、荧光定量PCR仪。,PCR仪,超净工作台
9、 恒温培养箱,生物培养设施,蛋白电泳槽和转印槽-用于western-blotting实验,蛋白质检测设备,酶标仪-用于ELISA（酶联免疫吸附实验）实验。,蛋白质检测设备,实验室除以上常规设备和设施外，还必须装备下列一些常用设备：A.通风柜：用于有害和有毒气体的操作。B.组织打碎机和匀浆器：用于各种生物材料、动植物组织和细胞的破碎。（研钵）C.超声清洗机：用于各种器皿、移液管和自动取液器吸头的清洗和高效液相色谱仪所用流动相的脱气等。,其它设备,其它设备,D.冰冻干燥机：用于生物大分子水溶液的冰冻干燥，可由其水溶液直接制得固体干粉。E.机械和水环式真空泵：用于旋转蒸发器和各种真空抽气操作。F.冷
10、室:4-10的冷室，工作人员可以在其中进行各种柱层析、各种电泳、生物大分子的提取和分离、透析等操作，并可以贮存各种生物制品和生化试剂。G.暗室:主要用于一些避光的实验，如显影。,H.基因导入仪：用于向受体生物细胞中导入基因。常用的导入仪有：电导入仪、基因枪、激光和超声导入仪、原生质体融合仪等。I.高效液相色谱仪和毛细管电泳仪：用于各种生物大分子的分析与鉴定。,其它设备,第二节分子生物学基本技术,分子生物学基本技术,-使用方法及注意事项,1)温度控制系统2)实验用水处理系统3)消毒系统4)计量系统5)离心设备6)电泳装置7)凝胶成像系统,1)温度控制系统,冰箱/柜的使用：门（随手关，关严）电源（
11、防止不小心关闭）微波炉：要用微波炉专用容器（不能加热金属、密封物）；不要让微波炉空转；微波炉工作时不要将眼睛紧靠微波炉5厘米之内去观看微波炉工作-眼睛对微波最敏感，以免受到不必要的伤害；防灼伤！不要徒手拿容器、不要把容器口冲着人！,1)温度控制系统,制冰机的使用：（水-进水、排水；电）1不论何种原因停机时，不得连续启动，要每隔5分钟再启动，以免损坏压缩机！2定时检查进、出水管接头，以便处理可能泄露的少量余水！3不用时，应排掉内胆内余水，用干净的布擦干储冰箱内胆！5在对制冰机进行清洁、检查及一周以上不用时，请拔掉电源插头。,1)温度控制系统,液氮罐（液氮生物容器）的使用：液氮是一种超低温液体(-
12、196)，如溅到皮肤上会引起类似烧伤一样的冻伤，在灌充和取出液氮时应特别注意。液氮罐主要结构：内胆、真空夹层（容器真空封口接头）、外壳、颈管、专用罐盖。注意：1、液氮罐只用于盛装液氮，不允许盛装其他液体；2、严防冲击和碰撞；3、操作及取放冷冻物品时，请注意要轻拿轻放；4、长期贮存时，需要定期补充液氮。,保持容器夹层真空的关键部件，用户不得擅自打开容器真空封口接头,1)温度控制系统,烘箱的使用：是利用电热丝隔层加热使物体干燥的设备。适用于比室温度高5300（有的高200）范围的烘培、干燥、热处理等，灵敏度通常为1。基本结构一般由箱体、电热系统和自动控温系统三部分组成。注意：1、每次使用前要根据烘
13、干物品要求确定合适的温度；2、物品不能排列太密，以免影响热气流动、散热；3、保证鼓风机正常运转；4、需要观察工作室内样品情况时，可透过玻璃门观察。但箱门以少开为好，以免影响恒温。特别是200以上时，开箱门可能使玻璃门骤冷而破裂。,不允许整夜使用！,1)温度控制系统,恒温水浴锅、恒温空气摇床：根据需要设置温度；恒温水浴锅中要保持足够的水量。,分子生物学基本技术,1)温度控制系统2)实验用水处理系统3)消毒系统4)计量系统5)离心设备6)电泳装置7)凝胶成像系统,防污染,3)消毒系统,高压灭菌锅1 在主体腔内加入适量的清水，将灭菌物品放入灭菌器内；2 盖好（注意密封胶圈）顶盖后必须拧紧顶盖；3 打
14、开灭菌器的热源，开启排气阀排完空气后（约在水沸腾后10 min15 min）关闭排气阀；4 将压力升至102.9 kPa(1.05 kg/),温度要求达121,维持到规定时间（根据物品性质以及有关情况确定,一般20 min30 min）;5 灭菌结束后,要待压力恢复到零位后开盖取物。对液体进行灭菌，容器不能密封、体积不能超过容积的2/3；灭菌结束后不能打开排气阀（尤其是上排气阀）。,分子生物学基本技术,1)温度控制系统2)实验用水处理系统3)消毒系统4)计量系统5)离心设备6)电泳装置7)凝胶成像系统,4)计量系统-质量,电子天平对环境高度敏感的精密电子测量仪器,使用时应小心操作,台面应无明显
15、振动,不要放在空调口。注意：1 调整底角螺丝使水平指示器的气泡居中。2 使用精密电子天平前最好热机1520分钟，以确保正确读取电子天平的数值。3 称量物品前先按（归零）键；称样时关上天平小门。4 称物品时，勿超过精密电子天平的最大称量，且需将物品放于称盘中心，需轻拿轻放，不要冲击称盘。5 严禁有腐蚀性的称物直接接触称盘与天平面板。6 使用完毕后，要清理称盘、面板，保持仪器清洁。,4)计量系统-体积,依称量需要选择合适的器皿-各种量筒、移液管、容量瓶。移液器：量程包括：0.1-2.5 ul，0.5-10 ul，10-100 ul，20-200ul，100-1000 ul，500-5000 ul。
16、单道可调移液器、多道可调移液器、电子调节/显示移液器。Tip头/吸头/枪头：10 ul（白），200 ul（黄），1 000 ul（蓝），5 000 ul（白）。,移液器使用方法及注意事项:,1.设定移液体积 从小量程调节至大量程时，逆时针旋转刻度；应先调至超过设定体积刻度，再回调至设定体积，这样可以保证移液器的精确度。2装配移液枪头将移液枪垂直插入吸头，左右旋转半圈，上紧即可。忌用移液器撞击吸头的方法是非常不可取的，长期这样 操作会导致移液器的零件因撞击而松散。,移液器使用方法及注意事项:,3吸液及放液垂直吸液：吸液前排空气体，吸头尖端浸入液面3mm以下慢吸慢放；放液时如果量很小则应吸头尖端
17、可靠容器内壁。绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞。4吸有液体的移液枪不应平放，枪头内的液体很容易污染枪内部而可能导致枪的弹簧生锈。5移液枪在每次实验后应将刻度调至最大，让弹簧回复原型以延长移液枪的使用寿命。,移液器使用方法及注意事项:,6切忌吸液时突然松开；吸有液体的移液枪平放；所设量程不在移液器量程范围内（会卡住机械装置，损坏了移液器）；严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如浓酸、浓碱、有机物等）；使用完没有将刻度调至最大量程。,分子生物学基本技术,1)温度控制系统2)实验用水处理系统3)消毒系统4)计量系统5)离心设备6)电泳装置7)凝胶成像系统,一般在低速离心时（转
18、速小于5000 r/min），离心力的大小常用转速r/min（rpm）来表示，而超速离心时则用离心力g或g来表示。由于离心管从管口到旋转中心的距离是不同的，所以在同样转速时，管口和管底所受到的离心力也有差别。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值，即离心管中点的离心力。,5)离心设备,低速离心机:最大转速6000 rpm左右，最大相对离心力近6000g，通常不带冷冻系统。超速离心机：大于3010 000 r/min，最大离心力600,000g，有驱动和速度控制系统，温度控制系统，真空系统（减少摩擦）。超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器
19、得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。,5)离心设备,高速（冷冻）离心机：最大转速为20 000-25 000rpm（r/min），最大相对离心力为89 000g。通常配有各种角式转头、荡平式转头、微孔板转头等，一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有数字显示。一般分子实验室必备的设备。,5)离心设备,角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。离心管腔的中心轴与旋转轴之间的角度在20-40度之间，角度越大分离效果越好。离心过程中，重心低，运转平衡，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管壁，然后再沿管壁滑向管底，因此
20、管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”。壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响分离效果。,角式转头,荡平式转头：这种转头有4或6个自由活动的吊桶（离心套管），当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速达到每分钟200到800转时，吊桶荡至水平位置。,微孔板转头：这种转头可离心高达 96孔微孔板、标准酶标板、PCR板等。,离心管主要用塑料和不锈钢制成：塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。塑料离心管都有管盖，离心前管
21、盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用：防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。防止样品挥发。支持离心管，防止离心管变形。,5)离心设备（耗材）-离心管,5)离心设备-使用注意事项,1.离心机应放置在稳定的台面上，以防离心机滑动或振动，出现事故；2.离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物、转头安装是否紧固。3.样品的装载和平衡：使用离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物；当转头只是部分装载时，管子必须互相对称（保证平衡）地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。,5)离心设备-使用注意事项,4.低温离心时，转头及离心机要预冷后再使用。5.装载溶液时，要根据
22、待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀。6.开始离心后请不要立即走开，需等待离心机达到设定转速后再离开，注意观察期间是否有声音异常；发现声音不正常时，要停机检查，排除故障（如离心管不对称、质量不等、离心机位置不水平或螺帽松动等）后再工作。,5)离心设备-使用注意事项,7.冷冻离心结束后，关掉电源，敞开离心机盖子，擦拭离心机内壁，防止凝结的水气化成水引起生锈。8.离心中有液体溅出，需立刻清理，防止腐蚀和生锈。9.离心时不准搬动离心机、不准开盖，不准用手停止转头。10.每次停机后再开机的时间间隔不得少于5分钟，以免压缩机堵转而损坏。1
23、1、每次离心完成后，将转子取出，否则长时间放在轴上，可能锈死。,分子生物学基本技术,1)温度控制系统2)实验用水处理系统3)消毒系统4)计量系统5)离心设备6)电泳装置7)凝胶成像系统,结构组成：全敞开式不漏光暗箱，防泄露紫外凝胶观察窗，自动升降折叠式白光平台及样品平台。全自动软件控制光源选择、滤光片选择、镜头马达驱动变焦/聚焦以及图像捕获使用注意：开机顺序，先开凝胶成像系统，再开电脑控制软件。凝胶成像系统的门、电脑不能用污染的手套接触。照相后把废胶取出，并用较软的纸擦拭干净。,7)凝胶成像系统,第三节实验安排,实验安排,实验二 组织DNA的提取-（4课时）实验三 琼脂糖凝胶电泳-（2课时）实验四 PCR扩增-（2课时）实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳-（4课时）实验六目的DNA片段的纯化-（2课时）实验七 DNA重组-（4课时）,实验准备,准备试验(第一次试验拿上小眼科剪)打扫卫生移液器：每组离开时检查移液器数目、是否归至最大量程；值日组最后走时再检查数目、量程。,实验报告一（电子版）,1组：分子生物学实验室规程2组：电泳系统污染与非污染区操作规程3-6组：制作实验仪器使用注意事项简明标签？包括：冷藏柜、空调、制冰机、液氮罐、微波炉、培养箱、恒温水浴锅、移液器、离心机、凝胶成像系统,实验报告,简述移液器使用注意事项？简述冷冻离心机使用注意事项？,
