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1、本科毕业论文（20_ _届）抗癫痫药物与血清白蛋白相互作用的光谱学研究所在学院 专业班级 环境工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 摘要: 蛋白质是生命有机体的重要组成部分，它几乎参与了所有的生命过程。本次实验采用荧光光谱法和紫外光谱法研究抗癫痫药物与牛血清白蛋白在缓冲溶液中的相互作用。结果处理运用荧光猝灭双倒数图计算在不同条件下二者的结合常数K；根据福斯特非辐射能量转移理论，求出不同温度时二者之间能量转移的效率和结合距离；根据热力学参数确定抗癫痫药物和牛血清白蛋白之间的作用类型。实验结果表明抗癫痫药物和牛血清白蛋白形成了复合物，且有较强的相互作用，以氢键和范德华力为主。荧光
2、技术表明抗癫痫药物对牛血清白蛋白的构象有影响。关键词:卡马西平；血清白蛋白；相互作用；荧光光谱 Abstract: Proteins are very important in living organisms and take part in almost all life processes. This experiment using fluorescence spectrometry and ultraviolet spectrometry research antiepileptic drugs and bovine serum albumin in buffer solution
3、interaction. Results treatment using fluorescence cu destroy double bottom graph calculation in different conditions the combination of two constants K; According to foster the radiation energy transfer theory, to work out the different temperature between energy transfer when the efficiency and com
4、bined with distance; according to the thermodynamics parameters antiepileptic drugs and bovine serum albumin of action between type. Experimental results show that antiepileptic drugs and bovine serum albumin formed complex, and a stronger interaction to hydrogen bond and Van der Waals force primari
5、ly. Fluorescence shows an antiepileptic drug of bovine serum albumin conformation of have influence. Keywords: Carbamazepine；Serum albumin ；interaction ；fluorescence spectrum目 录摘要IAbstractII1 绪论11.1 引言11.2 药物小分子与蛋白质相互作用的相关研究21.2.1 荧光光谱法21.2.2 红外光谱法31.2.3 紫外光谱法32 实验部分42.1 仪器与材料42.2 实验流程42.3 分析方法42.4
6、实验内容43 结果与分析63.1 荧光分析63.1.1 结合常数Kq确定63.1.2 Forster偶极-偶极无辐射能量转移估测药物分子113.1.3 荧光猝灭过程中热力学函数的变化与作用力判断123.2 紫外分析134 结论14致 谢15参考文献161 绪论1.1 引言癫痫是困扰人类的顽疾，我国的患者总人数在900万左右，患病率为7。癫痫的临床表现复杂，多种多样，在我国，很多患者尚未得到正规的诊断和治疗。长期反复出现的癫痫发作给患者带来了严重的躯体伤害，防碍到患者生活、学习和就业，造成严重而深远的社会心理影响。癫痫是常见的慢性惊厥性疾病，发作时脑部病灶发生一种异常的高频放电，并向病灶周围正常
7、脑组织扩散，引起脑细胞广泛的兴奋，从而出现特有的惊厥症状，并伴有运动、感觉、意识、行为、植物神经等功能障碍。在癫痫发作的治疗中，抗癫痫药物有特殊重要的意义，可通过两种方式来消除或减轻癫痫发作，一是影响中枢神经元，以防止或减少他们的病理性过度放电；其二是提高正常脑组织的兴奋阙，减弱病灶兴奋的扩散，防止癫痫复发。抗癫痫的药物有很多种如卡马西平、丙戊酸钠、苯巴比妥、苯妥英钠等。蛋白质是生命活动的基础物质，也是构成人体新生组织，维持人体健康的重要组成成分。血清白蛋白作为一种储存和运输蛋白，是血浆中含量最丰富的蛋白，它能和许多内源性或外源性物质结合。药物分子进人血液后随着血液循环分布于全身，必然不同程度
8、地与血浆蛋白(主要是血清白蛋白)结合。所以，药物一血清白蛋白的结合直接影响药物在生物体内的分布、贮存、转运、药效、药物代谢以及毒副作用等方面的性质。研究其与药物分子的相互作用，不仅对于阐明药物的运输与代谢过程非常有意义，而且对于阐明药物机理，药物动力学和进行药物分子设计、开发新药等也具有重要的指导意义1。 卡马西平（C15H12N2O2，图1.1），是一种常用的抗惊厥和抗癫痫的药物，用于治疗癫痫大发作、精神运动性癫痫和局限性癫痫等效果较好，亦可用于三叉神经痛。对某些精神疾病包括精神分裂症性情感性疾病，顽固性精神分裂症及与边缘系统功能障碍有关的失控综合征。预防或治疗躁狂-抑郁症。中枢性部分性尿崩
9、症它能通过与蛋白质中谷氨酸的作用稳定过度兴奋的神经细胞膜，抑制反复的神经放电，封闭电压依耐性纳离子通道，减少突然摸触对兴奋冲动的传递，起到抗惊厥和抗癫痫的作用心。图1.1 卡马西平结构式抗癫痫药物对多种条件引起的惊厥，均有不同程度的对抗作用。对人的各型癫痫如对各型小发作、肌阵挛性癫痫、局限性发作、大发作和混合型癫痫均有效，主要分布在细胞外液，在血中大部分与血浆蛋白结合。因此，研究卡马西平与牛血清白蛋白(BSA)相互作用对于了解卡马西平在人体内与蛋白质的结合方式、传输机理及药理作用具有理论指导和现实意义。1.2 药物小分子与蛋白质相互作用的相关研究 近年来，人们采用多种现代实验手段从不同角度对药
10、物与血清白蛋白之间的作用进行了广泛研究。目前常用的方法有：荧光光谱、傅里叶转换红外光谱、紫外光谱法、核磁共振、圆二色光谱、质谱、电化学、电泳等方法。1.2.1 荧光光谱法荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段2,3 ，它能提供包括激发光谱、发射光谱、斯托克斯位移、荧光强度、量子产率、荧光偏振和荧光寿命等参数。通过对这些参数的测定，可以推断蛋白质分子在各种环境中的构象变化、色氨酸或酪氨酸残基的微环境变化、蛋白质的变性等，从而进一步阐明蛋白质结构与功能的关系。同时，荧光光谱法还具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点，因此在研究药物小分子与蛋白质相互作用中荧光光谱占有重
11、要地位4,5 。荧光光谱法是研究小分子与血清白蛋白相互作用的主要手段，也是目前研究较为活跃的方法。蛋白质中色氨酸、酪氨酸的存在使其具有内源荧光，在345nm处有最大荧光峰。随着药物的加入，人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)的荧光强度有规律的降低，说明药物对HSA或BSA有荧光猝灭作用。根据猝灭曲线可以求得药物与HSA(或BSA)的结合常数，确定猝灭类型。根据荧光光谱和吸收光谱可获得药物与HSA(或BSA)的结合位点数，及药物与HSA、BSA上色氨酸残基的距离，根据反应焓变、熵变确定它们之间的相互作用力 。另外根据发射波长的移动可以判断蛋白质构象的变化。张勇等6利用荧光猝灭法研究了丝
12、裂霉素与血清白蛋白以及金属离子间的相互作用，结果表明血清白蛋白与丝裂霉素的结合常数KHsA=1.64104molL、KBSA=1.89l04molL，Fe3+、Zn2+、Mg2+存在使结合常数降低，Cu2+使结合常数增大。丝裂霉素与牛血清白蛋白的结合位点数为l，丝裂霉素距色氨酸残基距离rHSA=4.24nm,rBSA =3.76nm。它们之间的相互作用力为疏水作用力。黄波等7研究了阿霉素与牛血清白蛋白结合作用，结果表明阿霉素的加入使BSA的构象发生了变化。卢继新等8,9研究了在金属离子存在下甲氨喋呤、巯嘌呤与血清白蛋白间的相互作用，研究表明金属离子存在使药物与血清白蛋白之间的结合增强、结合位点
13、数发生改变。文献10副研究了氯丙嗪和氯高铁红素与牛血清白蛋白的相互作用，结果表明氯高铁红素可以增强氯丙嗪对的BSA猝灭作用，使BSA的构象发生变化。文献11,12则报道了抗生素类药物与血清白蛋白结合的作用模式。近年来该法也用于中草药中有效成分与蛋白质相互作用的研究13-16，得出一些有益的结论。1.2.2 红外光谱法红外光谱是研究小分子药物与血清白蛋白相互作用的新方法，它可以从蛋白质二级结构变化的层次来探讨其结构与功能的关系。谢孟峡等17运用蛋白质红外光谱酰氨带和酰氨带结合的方法对人血清白蛋白与-1，2，3，4，6-五-0-倍酰-D-葡萄糖(PGG)作用后二级结构的变化进行了定量分析，结果表明
14、随着药物浓度增加，PGG和HSA之间的相互作用主要使HSA的二级结构发生了a螺旋向-转角和无规结构的转化。刘媛等18应用衰减全反射傅里叶变换红外光谱研究了中草药三七总皂甙对牛血清白蛋白溶液构象的影响，实验表明随着三七总皂甙浓度增加，蛋白质分子结构逐渐发生了由螺旋向折叠的转化。谢孟峡等19研究了4、5、7-三羟基二氢黄酮与人血清白蛋白相互作用方式。1.2.3 紫外光谱法DNA分子中的碱基具有光学活性，在260nm波长附近有最大吸收。热和碱的作用可破坏DNA双链螺旋结构使双链变单链，260nm波长处吸光度增大。小分子与DNA结合后会给这种变性带来影响，可通过观察药物小分子与DNA作用前后，260n
15、m处吸光度随温度或pH变化来判断药物与DNA作用方式。当药物小分子与DNA发生嵌插结合时，由于插到DNA双螺旋碱基中的小分子对DNA结构起到稳定作用，可使DNA变性温度Tm值显著上升20,21，DNA 碱变性pH值会相应增大，增色效应相应减小20。文献22用碱变性曲线研究了有机锗配合物(Gel32)与DNA 的作用方式，初步判断Gel32以嵌插方式与DNA发生作用。药物小分子与DNA发生嵌插结合时也会引起吸收带的红移(蓝移)现象或增色减色效应。吸光度减小，吸收带红移及等吸收点的形成是小分子与DNA发生嵌插作用的光谱标志23。曹瑛等24用紫外光谱研究了吩噻嗪类药物与DNA的作用，结果表明具有平面
16、吩噻嗪环的三种药物盐酸氯丙嗪(CPZ)、盐酸三氟拉嗪(TFD)、盐酸异丙嗪(PMZ)与DNA作用的电子光谱不同。CPZ在306nm处有最大吸收，在约330nm处形成等吸收点，说明CPZ与DNA发生了嵌插作用，而TFD和PMZ却没此现象出现，说明它们与DNA作用方式不同于CPZ。2 实验部分 2.1 仪器与材料相关仪器 型号 厂家分子荧光分光光度计 Gary Eclipse Varian电子天平 AL204 METTLER TOlEDO 紫外分光光度计 UV-2550 SHIMADZU CORP药品 分子式 厂家卡马西平 C15H12N2O2 江苏恩华药业股份有限公司三羟甲基氨基甲烷（Tris）
17、 (HOCH2)3CNH2 北京鼎国生物技术有限公司 牛血清白蛋白V（BSA） 北京鼎国生物技术有限责任公司盐酸 HCl 衢州巨化试剂有限公司NaCl NaCl 宁波市化学试剂有限公司 2.2 实验流程配制PH=7.4 的Tris-HCl缓冲溶液用于体系的稀释剂，配卡马西平溶液和BSA溶液准备液，不同卡马西平溶液浓度与BSA相互作用的影响，通过分子荧光光谱分析和紫外分析予以讨论。2.3 分析方法荧光分析法，紫外分析法2.4 实验内容2.4.1 配制 0.1mol/L 1L PH=7.4 Tris-HCl 缓冲液（Tris-HCl 0.1mol/L ; HCl 0.1mol/L; NaCl 0.
18、1mol/L）2.4.2 配制2.510-5 mol/L BSA溶液（以Tris-HCl缓冲液为稀释剂） 配制1.510-4mol/L 卡马西平溶液（以Tris-HCl缓冲液为稀释剂） 2.4.3 准备5支10ml 容量瓶标为0、1、2、3、4、5.，各加入BSA溶液5mL，再分别对应加入0、1、2、3、4、5（ml）卡马西平溶液，用PH=7.4Tris-HCl溶液定容至刻度。摇匀，放置一段时间。 2.4.4 对5个样品在25C、30C、37C下进行荧光分析。2.4.5 对5个样品进行紫外分析。3 结果与分析3.1 荧光分析 对BSA预扫描，记录BSA最大激发波长228nm,最大发射波长339
19、nm。因此，以228nm为激发波长，记录BSA的荧光光谱及卡马西平对BSA的荧光猝灭，以228nm为激发波长，记录BSA和含不同浓度卡马西平时BSA的发射光谱。图3.1 卡马西平对BSA荧光猝灭光谱3.1.1 结合常数Kq确定分子间的作用不同可以导致不同的猝灭方式，典型的猝灭方式有动态猝灭和静态猝灭。二者的区别在于猝灭常数受温度变化影响的不同。动态猝灭是荧光体与猝灭体由于热运动等发生碰撞而引起的，它依赖于扩散，升高温度导致扩散加快，故猝灭常数将随着温度的升高而增大；静态猝灭是荧光体与猝灭体形成络合物，从而使荧光体的荧光猝灭由于升高温度将使化合物的稳定性降低，因此，静态猝灭常数的值将随温度的升高
20、而降低，且静态猝灭曲线对浓度的变化表现出较好的线性关系。为了确定此猝灭过程的机制，先按动态猝灭过程处理，那么服从Stern-Volmer方程： (1)其中F0为猝灭体不存在时的荧光强度，F为加入猝灭体后的荧光强度，kq为双分子猝灭常数，c(Q)为猝灭体浓度，0为猝灭体不存在时荧光体的荧光寿命(实验测得0的值在110 ns之间，为了计算方便，一些文献取0值为1 ns，另一些文献取0=l0ns，本文中取0=1 ns)，kd为Stern-Volmer常数，以F0/F -1对c(Q)作图，得到如下的结果，图3.2-3.4：图3.2卡马西平对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer曲线（25）图3.3卡
21、马西平对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer曲线（30）图3.4卡马西平对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer图（37）表3.1 BSA与卡马西平的双分子猝灭常数 药物 卡马西平温度（） 25 30 37Kq(ex=228nm)10120.1218 0.1245 0.1307 卡马西平与BSA相互作用，在228nm激发波长下，不同温度时的双分子猝灭常数kq，由表3.1可以看出，它们的值都远大于各种猝灭体对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数2.01010 (molL-1) -1S-1，说明了此猝灭过程不是由于动态猝灭引起的实验证实在228 nm波长激发下，卡马西平没有荧光，由图可以看出，B
22、SA的荧光峰位于339 nm左右，随着卡马西平浓度的增加，BSA的荧光强度有了不同程度的猝灭，而且BSA的荧光峰位没有发生改变，所以初步确定加入药物后，BSA的结构基本上没有发生变化。由此推测，此猝灭过程可能是由于卡马西平与BSA形成了缔合物而引起的静态猝灭，也就是说此猝灭过程是由于药物与BSA在基态时生成了复合物，从而导致BSA的荧光强度猝灭。卡马西平和BSA的结合常数较大，形成结合位点，且受温度影响较大，说明卡马西平与BSA有较强的结合作用，可以被蛋白质运输和储存。根据方程： (2)以 对作Lineweaver-Burk双倒数图(图3.5-3.7)，由直线斜率，求得在228 nm波长激发下
23、，卡马西平与BSA作用的结合常数k，其结果如表所示：图3.5 BSA的荧光强度与卡马西平的双倒数图（25）图3.6 BSA的荧光强度与卡马西平的双倒数图（30）图3.7BSA的荧光强度与卡马西平的双倒数图（37）表3.2 不同温度下BSA与卡马西平的结合常数温度 (C) 25 30 37K (L/mol) 0.05546 0.05500 0.05455活化能是指化学反应中，由反应物分子到达活化分子所需的最小能量，根据阿伦尼乌斯方程lnKlnAEa/RT，由lnk对1/T作图，由斜率可得BSA与药物结合的活化能Ea为2529.23 kJ/mol , 该活化能成为阿伦尼乌斯活化能或者经验活化能，表
24、示活化分子的平均能量与反应物分子平均能量的差值，温度升高，使体系中分子间的碰撞的几率增加，BSA与卡马西平分子的有效碰撞加剧，产生的活化分子增多。活化能与反应的反应速率的大小有着密切的关系，活化能越小反应的速率越大，从该结合反应的活化能来看，活化能较小，说明结合反应在相对较短的时间内完成，速率较大。3.1.2 Forster偶极-偶极无辐射能量转移估测药物分子根据Forster理论，无辐射能量转移效率E可表示成： （3）其中R0为转移效率为50时的临界距离，表示为： （4）其中K2为空间取向因子，K2=2/3，D为供体的荧光量子产率，D=0.118，n是介质的折射指数，n= 1.336，J为供
25、体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱之间的光谱重叠积分： （5）其中FD()为荧光供体在波长为时的荧光强度，()为受体在波长为时的摩尔消光系数能量转移效率E还可以表示为： （6）式中F为c(药物)：c(BSA)=1：1时的荧光强度，F0为未加入药物时的荧光强度根据式(3)(6)可以求得在228 nm波长激发下，不同的J，E和r值. 以25C为例：E=1-F/F0=0.0235 J=1.976 1016 cm6Lmol-1 R06=8.810-25(2/3)21.336-40.1181.9761016 r=2.37nm3.1.3 荧光猝灭过程中热力学函数的变化与作用力判断药物等有机小分子和蛋白质等生
26、物大分子之间的结合力主要有疏水作用力、氢键作用力、范德华力和静电引力等。Ross等根据大量实验规律总结，利用反应前后热力学焓变H和熵变S的相对大小来判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型：H 0，S0为疏水作用力；H0，S 0为氢键和范德华力；H0为静电引力。在温度变化不大时，反应的H可以看作一个常数。由下列公式可得G、H和S。应指出BSA结构很复杂，药物与它之间往往同时存在几种作用力。根据以上公式求得荧光猝灭实验中，卡马西平与BSA结合反应的热力学函数值，如表3.3可知荧光猝灭实验推测出卡马西平药物与BSA之间的主要作用力均为疏水作用力。表3.3 BSA与卡马西平相互作用的热力学常数及作用力温
27、度（） Kb(L/mol) H(KJ/mol) G(KJ/mol) S(J/(molK) 作用力类型25 0.05546 -7.168 30 0.05500 -1.054 -7.310 -27.52 氢键和范德华力37 0.05455 -7.500 3.2 紫外分析图3.7 卡马西平与BSA相互作用的紫外光谱图图3.7是卡马西平与BSA相互作用后的紫外谱图。可以看出，随着卡马西平的物质量的增加，BSA的吸光度均有规律的增大，且谱图的形状发生了明显的变化，表明卡马西平与BSA之间发生了相互作用，因为若卡马西平与BSA未发生相互作用，则其吸光度的增加是由卡马西平的量增加造成的话，谱图叠加后的形状不
28、会发生改变。这与荧光谱图是相互吻合的。4 结论光谱分析法是研究药物小分子与生物大分子间相互作用的重要方法。文中运用荧光光谱和紫外吸收光谱对卡马西平药物与牛血清白蛋白的相互作用机制进行了研究。确定了卡马西平药物对牛血清白蛋白的猝灭并非分子间的动态碰撞所致，而是由于形成复合物所引起的静态猝灭。卡马西平药物与牛血清白蛋白之间有较强的结合作用，得出了结合常数和活化能。通过荧光猝灭过程中热力学函数的变化，得出卡马西平药物与牛血清白蛋白之间的作用力为氢键和范德华力，且卡马西平与牛血清白蛋白之间的结合是自发进行的。在卡马西平存在下，牛血清白蛋白的内源荧光发生规律性的猝灭，结合福斯特非辐射能量转移理论，可确定
29、卡马西平与牛血清白蛋白之间发生的是非辐射能量转移。同时紫外光谱表明，卡马西平与牛血清白蛋白发生了相互作用。参考文献1余军平荧光光谱法在药物分析及药物与生物分子作用中的应用研究D武汉：武汉大学，20042JOHN C C,DVAID D J,ROBERT R L.Fluorescence spectroscopy in biochemistry:teaching basic principles with visual demonstrationsJ.Biochem.Mole.Biology Edu.2001,29:60-653BROWN M P,ROYER C.Fluorescence spe
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