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1、无菌技术学习心得 无菌技术学习心得1无菌操作基本技术1.在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放于操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒，以避免往返拿取造成污染机率增大。超净工作台台面每次实验前用75%酒精擦拭，按照顶板侧壁器械挡风玻璃操作台面的顺序对超净台内部进行彻底的消毒。然后开启超净台和无菌培养室的紫外灯照射30min，关闭紫外，启动风机运转15分钟后，方可开始实验操作。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒
2、等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流流通。实验用品以75 % 酒精擦拭后放入无菌操作台内。实验操作应在台面中央的无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3. 小心取用无菌实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖端或容器瓶口，亦不要在开口容器的正上方操作。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用。4. 操作人员应注意自身安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级的无菌操作台。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心毒性药品，例如DMSO，并避免尖锐针头的伤害等。5. 每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同也不共享培
3、养基，以避免失误混淆或细胞间污染。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶;用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。6. 实验完毕后，关闭超净台风机，以75 %酒精擦拭操作台面及其他实验物品，将多余的物品拿出超净台，打开风机运转15 min，关闭风机并打开紫外灯照射30min。7. 定期检测CO2 钢瓶的CO2 压力 ; CO2 培养箱的CO2 浓度、温度、水盘是否有污染(水盘的水为无菌水，每周更换);定期更换紫外
4、线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手：1、添加抗生素2、从物品、用品消毒灭菌着手(1)细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。(2)操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。3、从操作者做起(1)进无菌室前要用肥皂洗手，按规定穿隔离衣。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。(2)操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若
5、打喷嚏或咳嗽应转向背面。(3)操作时要常更换吸管，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕用消毒水浸泡的纱布擦台面。4、防止细胞交叉污染(1)在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。(2)在进行换液或传代操作时，手或注射器、滴管等不能经过开口瓶口上方，不能触及瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。(3)细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养。5、无菌室的彻底消毒(1) 0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室;(2)甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。容器破碎及感染性物质的溢出的处理：1 小玻璃瓶及其他容器等被传染性物质污染的破碎物品，以及培养物等溅洒的传染性物质，应当立即佩戴手套用布或纸巾覆盖。2 在上面倒上消毒剂，并使其作用适当时间。3 清理破碎物品及污染物，再用消毒剂擦拭污染区域。4 用于清理的布等应当放在盛放污染性废弃物的容器内。5 如果实验表格或其他材料被污染，在妥善转抄或拷贝后，应当将其弃入污染废弃物容器。
