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1、第三章 污染物的生物效应检测,本章将讨论以下内容生物测试及方式一般毒性试验生物的分子和细胞水平检测生物致突变、致畸和致癌效应检测微宇宙法,第一节 生物测试及方法,一、生物测试（Bioassay）的概念、特点：1、概念：指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。注释1：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应。注释2：生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测定污染物对生物机体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。,2、特点：长期、综合3、生物测试的结果可表明（以水环境为例）：环境状况对水生物的适合度（
2、最适、耐受、生存）环境因素的作用强度环境因素对毒物的影响,毒物对受测生物的毒性水生物对污染物的敏感性废水处理的效果污染物允许排放量有关水质标准和排放许可的验证,二、方式,三、受试生物1、应满足的条件受试生物敏感性广泛的地理分布和足够的数量重大生物学价值易于在实验室培养丰富的生物学背景资料反应可测经济及旅游价值,2、还应考虑到受试生物的个体大小和生活史的长短，以前是否有过接触待测试物等异常情况。四、生物测试的标准化 1、影响生物测试结果的因素：受试生物；试验条件；实验室差异 2、测试方法标准化的优点：实验可比性；重复性；精确性；可靠性,第二节 一般毒性试验,一、基本概念1、毒物（Toxicant
3、）的概念 一定条件下，较小剂量即可引起不良生物反应的外来化学物质。2、中毒（Intoxication）生物体受到毒物作用引起功能或器质性改变后出现的疾病状态称中毒。3、毒性（Toxicity）指有毒物质接触或进入机体后，引起生物体的易感部位产生有害作用的能力。,4、无损害作用：可逆的生物学变化，不引起机体形态、生长发育和寿命的改变。5、损害作用：不可逆的生物学变化，对某些环境因素不利影响的易感性增强，代谢速度降低和酶系的相对活力发生异常改变。,6、效应（Effect）也称为作用，对个体而言，指接触一定剂量化学物后，使机体产生的生物学改变。7、反应（Response）对群体而言，指接触一定剂量化
4、学物后，产生某种效应并达到一定强度的个体在群体中所占的比例。,8、剂量效应关系和剂量反应关系剂量效应关系曲线：以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位为纵坐标剂量反应关系曲线：以剂量为横坐标，以表示反应的百分率或比值为纵坐标不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量与效应或反应的相关关系不同，可呈现不同类型的曲线（见图3-1，3-2，3-3，3-4）。,剂量效应关系和剂量反应关系曲线图,9、危害性（Hazard）：有毒物质在与机体接触或使用的过程中，有引起中毒的可能性。与风险（Risk)相近10、危险性：某化学物质在正常生产和使用条件下，能引起机体发生中毒的可能性。偏重物质本身性质（与“毒性
5、”相近）。,二、常用毒性试验参数1、致死剂量/致死浓度：LD/LC 表示一次染毒后，在一定时间内引起受试动物死亡的剂量或浓度。绝对致死剂量/浓度（LD100、LC100）半数致死剂量/浓度（LD50、LC50）最小致死剂量/浓度（MLD、MLC）最大耐受剂量/浓度（LD0、LC0）,2、无作用剂量（NOED:Maximum Noeffect Level）随实验方法的改进而变化（降低）a、最大无作用剂量（MNEL:Maximum Noeffect Level）每日容许摄入量（Acceptable Daily Intake）最高容许浓度（Maximum Allowable Concentratio
6、n）b、最小有作用剂量（MEL:Minimal effect Level）3、毒作用带：一种根据毒性和毒性作用特点综合评 价外来物危险性的指标。是对LD50的补充。急性毒作用带（Acutetoxic Effect Zone）慢性毒作用带（Chronic toxic Effect Zone）,4、半效应浓度：在一定时间内，引起50%受试生物的某种效应变化的浓度。只有同种效应才能比较。5、半数抑制浓度：常用于对生长速率和活性的抑制。6、毒物单位与分级：mg/L,mg/kg,mg/m2 分级：按急性毒性，人为分级。与染毒方式有关。,三、急性毒性试验（Acute Toxicity Test）只研究结果
7、，不研究机理，目的是找出造成某特殊急性效应的剂量，为进一步开展其他毒性实验提供设计依据。1、急性毒性试验类型哺乳动物急性毒性试验（大小鼠、豚鼠、兔子）水生生物急性毒性试验（鱼类、水藻、水蚤）蚯蚓急性毒性试验,2、试验方法（p103）材料与条件 实验设计 染毒方式 统计计算,四、亚急性与慢性毒性试验 必要性：机理探讨、敏感指标、多指标、综合性指标、特殊性指标、敏感阶段、NOEC 应用系数（AF）：慢性毒效应与急性毒效应的关系。可以推算慢性毒效应值五、蓄积毒性试验 1。试验方法 2。剂量蓄积与效应蓄积,第三节 生物的分子和细胞水平检测,一、生物（学）标志物（biomarker）1、概念：化学污染物
8、导致生物有机体的生物化学和生理学的改变，这些改变运用于监测和评价污染物的暴露及其效应则称为生物标志物。2、分类：作用：暴露生物标志物（Exposure biomarker）效应生物标志物（Effect biomarker）复合生物标志物 效应：行为、生理、生化,3、特异性 生物标志物的特异性差异很大，高度特异性和非特异性生物标志物在化学品危害的监测和评价中都有应用价值。4、基本原则：指示性、敏感性、特异性 5、在监测和评价中的应用：预警作用 6、局限性：相对复杂、生态相关性低,选择生物标志物的原则：1）能在较高生物水平发生显著效应之前被测量（预警作用）；2）测定快速、经济且足够容易，适于广泛应
9、用（实用）；3）测量服从于标准的质量控制/质量保证（可标准化）；4）最好对毒物种类有特异性（非特异性也有价值）；5）与毒物有清晰的剂量-效应关系；6）能被应用于广泛的敏感性物种（野生、家养、地方性）；7）与个体以上水平效应的联系比较理想（不总是必需）。,二、测定方法1、DNA加合物 是化学物经生物转化后的亲电活性产物与DNA链特异位点上的共价结合物。a、免疫法：抗原抗体反应，根据应用技术又可分为放射免疫（RIA），酶联免疫（ELISA）及超敏酶学放射免疫法（VS-ERISA）。b、荧光法：某些化合物的DNA加合物具有荧光特性而进行定量。同步荧光法、低温激光法和激光发射荧光法。不破坏DNA链，可
10、区分加合物的不同立体异构体及DNA链不同位点上的加合物。c、32P 后标记法：先将DNA水解，用32P标记的ATP将带有加合物的单核苷酸标记进行定量，有极高的灵敏度。,2、蛋白加合物 血红蛋白（Hb）（亲核中心），在一定程度上可以代替 DNA用于检测加合物。3、代谢酶活性 a、乙酰胆碱酯酶（AChE）：可作为有机磷农药污染的指标，已被用到了定量活性关系（QSAR）的研究。b、腺三磷酶（ATPase）：它的作用是水解高能化合物ATP而释放出供生命活动所用的能量。,4、酶诱导（浓度+活性）a、混合功能氧化酶（MFO）：ELISAb、谷胱甘肽硫转移酶（GST）5、抗氧化酶系统 a、过氧化氢酶（Ct）
11、：催化分解细胞代谢产生 的H2O2,污染物与Ct的巯基或其他活性基团相互作用。b、谷胱甘肽过氧化酶（GPx）：清除脂类过氧化物，可代替Ct清除H2O2。,第四节 生物致突变、致畸和致癌效应检测,一、致突变效应1、基本概念a、基因突变（Gene Mutation）只涉及染色质的一部分改变，不能用光学显微镜直接观察。诱变(induced mutation):外来因子作用下的突变。b、染色体畸变（Chromosome Aberration）染色体数目、结构发生改变，可以用光学显微镜直接观察。,2、试验目的致突变试验的目的是为了检查受试物对机体遗传过程有无影响的方法。3、试验方法：根据终点反应不同分为
12、如下几种，体外基因突变试验，例如Ames试验，下文以鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法为例介绍。细胞遗传学试验体内基因突变试验DNA损伤试验,Ames试验Ames试验原理同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这种突变叫做回复突变。注释1：营养缺陷型突变型菌株注释2：野生型微生物,鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法方法原理：在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活化后，检测其所诱发的沙门氏菌回变菌落数，即由不能自行合成组氨酸的营养缺陷型突变菌株（his），回复为能自行合成组氨酸的（his）菌落数。突变率诱
13、发回复突变菌落数/自发回复突变的菌落数（对照）当突变率大于2.0时，为阳性结果。,二、致畸效应,1、致畸作用（Teratogenesis）致畸物通过母体作用于胚胎而引起胎儿畸形的现象称为致畸作用。2、致畸作用的毒理学特点 a、不同发育阶段敏感性不同 b、不同发育阶段畸形不同 c、种属差异明显 d、致畸作用带较窄,3、化学致畸作用机理突变引起胚胎发育异常；对细胞的生长分化较为重要的酶类受到抑制；母体正常代谢过程被破坏；细胞分裂过程的障碍,4、致畸试验致畸试验的目的检测环境污染物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形。一般试验动物要求其对化学物质的代谢过程与人相似，胎盘结构也相似，还要求孕期短，产仔多，经济
14、实用，如家兔、大鼠、小鼠等。,5、致畸作用的评价注意与自然变异区分；注意种属差异；注意试验的阈剂量与人类实际可能摄入量之间的差别。,三、致癌效应,1、癌的定义：细胞自主生长，不断分裂形成危害机体的肿块（恶性肿瘤）。特点：自主分裂、可移植、退行发育、膜异常 化学 2、致癌机理 物理：射线 生物：病毒细胞癌变学说：体细胞突变细胞分化失常,3、发展阶段：a、引发阶段：通过致癌物的作用，使正常细胞转化为癌细胞的过程。b、促长阶段：被经过引发的癌细胞不断增殖直至形成一个临床上可检出之肿块的过程。c、浸润和转移阶段：已形成的癌肿不断发展，逐渐侵害周围的正常组织，并扩散到较远的部位。浸润：癌细胞分泌毒素，侵
15、蚀和破坏体内各种组织和器官。转移：癌细胞从初生肿瘤中离散，随血液循环向全身扩散。,4、恶性肿瘤分类：癌：从上皮组织、腺体等长出来。如皮肤癌、胃癌、乳腺癌。肉瘤：从间叶组织长出来。如骨肉瘤、淋巴肉瘤。癌:肉瘤 9:1血癌？5、试验方法：a、短期筛选方法 b、长期动物诱癌试验 c、观察指标,第五节 微宇宙法,一、微宇宙法（Microcosm）是研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生物圈水平上的生物效应的一种方法，又称为模型生态系统法（Model Ecosystem）。微宇宙可分为自然微宇宙和人工微宇宙。自然微宇宙直接来自自然生态系统的一部分，是自然生态系统的断面。人工微宇宙是研究者根据他们所需研
16、究的生态系统的特征在实验室组建的人工生态系统，也可在野外组建。,1、标准化水生微宇宙（Standardized Aquatic Microcosm，SAM），人工用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生态系统的影响。试验时间64天，容器为4L的玻璃广口瓶，试验生物包括10种藻、4种无脊椎动物、1种细菌。对温度、光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。,2、烧杯水生微宇宙（Mixed Flask Culture，MFC），人工、较小又称烧杯混合培养，试验时间1214周，容器为1L的玻璃广口瓶，试验生物包括4种藻、2种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。对温度、光照强度、pH值等理化参数均有具体要
17、求。与SAM不同的是通过加入来自生态系统浸出液提供给微宇宙中生物群落所需的基质。,3、室外水生微宇宙（Outdoor Aquatic Microcosm），人工、自然。包括一些大型的捕食者如鱼类。又称中宇宙（Mesocosm），试验单元6 m3，试验生物包括浮游植物、浮游动物、鱼类、大型水生植物和无脊椎动物。,4、土壤核心微宇宙（Soil Core Microcosm，SCM），自然该法采用野外环境的土壤核心，将其设置在环境条件控制的实验室中，试验生物因土壤核心采集场所不同而不同，可研究化学物质和营养元素对农业生态环境的影响及其环境归趋。,5、模拟农田生态系统，人工该系统模拟农田条件，无陆生动物，为同时测定农药在土壤、植物、水溶液和空气中的残留而设计，采用0.75 m3的矩形玻璃室，可打入足够数量的空气，通过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药。,二、现场围隔生态系统（Enclosed Ecoystem）将野外的自然环境人为围隔起来，研究近自然环境因素条件下污染物的生态效应。1、海洋（水体）围隔2、潮间带围隔3、淡水水体围隔（可以包括底质）三、优缺点：生态代表性强；可重复性差,作业3：查文献资料，针对三、四章的内容，每组准备15分钟的介绍（ppt形式），四个人一组。,
