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1、第4章 酯 酶,4.1酯酶的定义、来源及分类,RORH2O RHROH 酯 酸醇甘油三酯H2O甘油二酯（或甘油一酯 或甘油）脂肪酸,酯酶和脂酶同义吗？,？酶,？酶,酯酶（esterase）,催化酯类中酯键裂解的酶类，反应可逆。水解时，产物为酸和醇类；合成时，把酸的羟基与醇的醇羟基缩合并脱水，产物为酯类及其它香味物质。RORH2O RHROH 酯 酸醇,脂酶(Lipase，EC 3.1.1.3),甘油酯水解酶，脂肪酶，是酯酶中的一类，催化甘油三酯水解生成甘油二酯或甘油一酯或甘油。甘油三酯H2O甘油二酯（或甘油 一酯或甘油）脂肪酸,酯酶分布和来源,酯酶广泛分布于植物、动物和微生物动物胰脏酯酶和微生
2、物酯酶是主要来源。主要是真菌，12属233种，其次是细菌。酯酶已经实现商品化，在食品、医药、化工等领域起着重要作用。,羧基酯类（E.C.3.1.1）磷酸单酯（E.C.3.1.3）磷酸二酯（E.C.3.1.4）三磷酸单酯（E.C.3.1.5）硫酸酯（E.C.3.1.6）硫酯（E.C.3.1.6）,酯酶,脂酶,羧酸酯（EC3.1.1.1)芳基酯(EC3.1.1.2)乙酸酯(EC3.1.1.6),甘油酯(EC3.1.1.3),叶绿素酶(EC3.1.1.14)果胶酯酶(EC3.1.1.11)乙酰胆碱酯酶(EC3.1.1.7),磷脂酶,磷脂酶A(EC3.1.1.4)磷脂酶B(EC3.1.1.5),种类,
3、4.1.2酯酶的分类（E.C.3.1）,常见类型,依据酶对底物的特性分为非特异性和特异性酯水解酶,非特异性酶,羧酸酯水解酶作为以脂肪族和芳香族醇的羧酸酯为底物的酶可以作用于乙酸乙酯、丁酸乙酯、甘油三丁酸酯、乙酸苯酯；乙酸酯水解酶是以乙酸脂为底物的酶可以作用于乙酸乙酯和乙酸苯脂,特异性酯酶,分为醇特异性和酸特异性醇可以是一元醇或多元醇、脂肪族醇或芳香族醇；酸可以是有机酸或无机酸。如羧酸酯水解酶中有磷脂酶、叶绿素酶、乙酰胆碱酯酶、果胶酯酶等。,特异性脂酶,酰基甘油专一性优先水解相对分子质量不同的三酰基甘油。位置专一性酶包括1,3位置专一、和单一位置专一性酶。脂肪酸专一性在水解一类脂肪酸形成的酯键时
4、比另一类脂肪酸形成的酯键来得快。立体异构专一性,4.2酯酶的催化特性,4.2.1酯化作用中酯酶的催化特性,非极性溶剂适合于酯化合成，控制酯化系统中的水含量，有利于向合成方向进行。及时移出反应产物可促进酯化反应继续进行酶的非水相催化酶的固定化例如，在甘油单酯的生产过程中，利用固定化酶膜反应器技术和吸附柱回收体系中的单酰基甘油，产率可达90%以上，膜反应器若连续生产，每克酶可生产15kg的甘油单酯。,4.2.2脂酶的催化特性,脂酶的天然底物是不溶于水的，脂酶作为水解酶能作用于乳化的脂肪球,100ml甘油三油酸酯乳状液中界面面积1052,胰脂酶作用于不溶解的甘油三酯时，酶活力和乳化液界面面积的关系B
5、甘油三丁酯O甘油三油酸酯,脂酶活力的测定,最适pH和最适温度随底物、脂酶的纯度、缓冲液和测定的方法不同而稍有改变。大多数脂酶的最适pH在碱性范围，即pH89，如胰脂酶的最适pH为89，但是也有一些脂酶具有酸性的最适pH。不同的微生物脂酶的最适pH存在着很大的差异，它们的范围为5.68.5。,1972年从土壤中分离筛选出我国第一株碱性脂肪酶产生菌并首创了维多利亚蓝快速平板鉴别法分离到碱性脂肪酶野生型菌株,维多利亚蓝快速平板鉴别法（初筛）维多利亚蓝加入培养基，调pH，取各种试样在琼脂平板上涂布培养，如在其周围产生蓝绿色圈者，表明脂肪被水解成脂肪酸。酶活性测定方法（复筛）橄榄油乳化液，pH9.4，3
6、7C水浴，反应一定时间，用NaOH进行电位滴定酶活单位定义：每分钟释放出游离的一微克分子的脂肪酸所需的酶量为一个活力单位U。,采用对硝基棕榈酸脂(pNPP)法：Experiments were carried out in a volume of 5ml containing 10 mM pNPP and 1M ethanol in n-heptane,and then 25l samples lipase for 5min at 40C.Liberation of pNP（硝基苯酚）was detected using a common spectrophotometer and detec
7、ted at 410nm after extracting aliquots of sample from the reaction medium with 1ml of 0.1M NaOH solution.,乙酰胆碱酯酶的催化特性,乙酰胆碱酯酶（acetylcholine esterase，EC 3.1.1.7）存在于所有动物的神经组织中，它催化下列反应：（CH3)3N+CH2CH2OCOCH3H2O(CH3)3N+CH2CH2OHCH3COOH+,乙酰胆碱酯酶在将神经脉冲从神经细胞传递至运动肌神经原后立即发生此反应。一些有机磷化合物、氨基甲酸酯和许多其他化合物对乙酰胆碱酯酶具有不可逆的抑
8、制作用，因此，这些化合物是有毒的，这也是它们杀灭昆虫的机制。,果胶酯酶的催化特性,果胶酯酶（Pectinesterase，PE,EC3.1.1.11）存在于高等植物组织中，真菌、酵母、细菌中也产生。对半乳糖醛酸甲酯具有高度专一性催化果胶脱酯，生成果胶酸，与钙离子桥连，形成凝胶，提高果实的硬度。苹果酒生产工艺,4.3酯酶的应用现状及前景,4.3.1 催化合成芳香酯4.3.2催化合成单甘酯4.3.3催化合成糖酯4.3.4催化合成磷脂4.3.5三酰甘油的改性4.3.6在提取维生素E中的应用4.3.7在食用油脂精炼中的应用4.3.8在功能性油脂分离和纯化中的应用4.3.9在面制品中的应用,4.4.1催
9、化合成芳香酯,低分子量芳香酯是一类重要的芳香化合物，多呈天然水果香味，它们广泛应用于食品、饮料等食品工业中。酶法生产被看成很有希望工业化生产芳香酯类的途径。商业上重要的低分子量酯可以在无水有机溶剂中或无溶剂环境中经过转酯生产，也可以由酸与醇直接酯化合成。固定化脂肪酶现已用于芳香酯的合成。生产多种脂肪族和芳香族香味酯，如乙酸乙酯、丁酸异戊酯、癸酸异戊酯、乙酸香叶酯、月桂酸丁酯、安息香酸甲酯等。,美国把乳脂或黄油乳化后加酯酶保温催化，释放出脂肪酸，获得的酯化香味液比黄油的香味高150倍。意大利在利用酯酶使干酪增香获得成功国外利用酯酶把乙醇和酪酸进行酯化，获得具有特殊芳香味的酪酸酯。日本利用酯酶合成
10、具有浓郁香味的甘油酯等酯类,我国利用酯酶，提高浓香型曲酒中的已酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等四大酯的含量，应用此技术后，优级率提高10.18%。利用酯酶提高食醋的风味，特别是提高食醋中乙酸乙酯和乳酸乙酯等酯类的含量，效果较为明显，一般乙酸乙酯提高5%10%。乳酸乙酯提高3%8%，口感有明显地提高。,利用脂肪酶和酯酶增香,甘肃渭水酒业集团 2003 年利用酯酶增香技术，已生产出己酸乙酯生物合成酯香液，合成酯香液的己酸乙酯含量以 100mL酯香液中酯含量计,酯化 10d 生酯量为 1080mg，30d 为 2370mg，60d 为 4180mg，90d 达到 7230mg 水平。生产的酯香
11、液已用于成品酒（中低档酒）的勾调，明显好于外购香料。主要优点是酒体自然感强、绵甜、主体香突出。,4.4.2催化合成单甘酯,单甘酯是世界上用量最大的食品乳化剂工业上主要使用碱催化法将油脂甘油水解（200260，30min），由于高温对不饱和成分是不适合的，酶法生产单甘酯或双甘酯已被广泛研究。,酶法生产单甘酯的方法,甘油与酸、烷基酯相互作用发生直接酯化或转酯化。利用甘油和油酸或油酸乙酯生产单油酸甘油酯；三酰甘油部分醇解和甘油解；利用三棕榈酰甘油酯生产单棕榈酰甘油酯。利用单甘酯较其他甘油酯熔点高，选择适宜的反应温度，使单甘酯从反应体系中析出而大大提高产量；在动物脂、棕榈油、大豆油、菜子油、等均有报道
12、。,4.4.3催化合成糖酯,用单糖或双糖代替甘油制备类脂分子，酰基化的糖不仅具有特有的营养特性，并为可作为良好的表面活性剂。糖酯可以作煎炸油，也可作为一些产品如冰淇淋、人造奶油、奶酪和焙烤食品的脂肪代用品，其无毒、无味、无刺激性、无致癌变作用，因很难吸收，提供的能量几乎等于零。谷物中存在半乳糖二酰基甘油占总酯量的25，面包的焙烤有用,催化合成糖酯的方法,特异的脂肪酶可通过催化糖或糖醇与脂肪酸或酯反应生产糖酯。如利用甲基葡萄糖苷及烷基葡萄糖苷与油酰甲酯之间的酯化反应生产葡萄糖酯时，为得到乳化效果最好的单酰糖酯，利用脂肪酶的位置选择性阻断叔羟基而使伯羟基与脂肪酸反应生成蔗糖单酯。针对糖在有机溶剂中
13、溶解度低、产率低等缺点，固体反应底物可大大提高糖酯合成比例；,4.4.4 催化合成磷脂,溶血磷脂具有重要的生理功能，并被作为良好的乳化剂广泛用于食品、医药和化妆品中。溶血磷脂的脂肪酸，可经酶促合成方法转到溶血磷脂中。一般是利用sn-1、sn-3位置专一性脂肪酶通过醇解和转酯方式合成溶血磷脂，其中将长链多不饱和脂肪酸转入溶血磷脂中。磷脂酶用来将鱼油中的多不饱和脂肪酸掺入磷脂中，改善其营养价值。,4.4.5 三酰甘油的改性,天然存在的油脂因具有链长、饱和度不同的脂肪酸而具有不同的物理、化学性质和营养特性，产量与储藏稳定性也不尽相同。为获得具有特定物理和化学性质的油脂，更好地提高油脂的营养、稳定性，
14、提高产品品质，需要对天然油脂进行改性以提高其使用价值。目前油脂改性以化学改性为主，但随着非水介质脂肪酶催化反应研究的不断深入，脂肪酶催化的油脂改性已被广泛研究，并在一些生产中得到应用。,4.4.5.1 结构化脂质的生产,结构脂质由于特定结构而具有功能性的三酰甘油。如sn-1位和sn-3位上是短中链酰基的三酰酯，易被胰脂肪酶水解成sn-2甘酰酯和中链脂肪酸，sn-2甘酰酯在肠中可被吸收而短中链脂肪酸可快速分解供应能量；具有二个中链（C8C12）、一个长链的三甘酯，特别是MLM三甘酯，其长链酰基位于sn2位上是近期倍受关注的结构脂质。,结构酯质的生产,如多不饱和脂肪酸（PUFA）对心血管疾病有较好
15、的疗效，降低糖尿病、高血压和癌症的发病率，增加免疫力，促进儿童神经发育。而长链PUBA的吸收有一定困难，且二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）对消化道有一定的刺激作用，以天然脂类化合物形式富集PUFA，促进PUFA的吸收具有应用意义。强化PUFA的方法很多，非水相脂肪酶催化的方法包括以下几种：,（1）脂肪酶催化酯化反应,脂肪酶催化PUFA与甘油之间发生酯化反应，生成单甘酯（14%，含27%EPA和50%DHA），双甘酯（43%，含25%EPA和50%DHA）和三甘酯（37%，含25%EPA和50%DHA）。,（2）脂肪酶催化转酯反应,植物油、鱼油和其他油与富含PUFA的脂肪酸、酰基
16、酯发生转酯反应，将EPA或DHA、g-亚油酸等整合到几种植物油（低介酸菜子油、花生油、高油酸向日葵油、大豆油，玻璃苣油），三辛酰甘酯和三癸酰甘酯等中，也可部分水解后再酰化来提高天然鱼油中PUFA含量。利用1,3位置专一性酶，可将EPA整合到短链和中链三甘酰中，催化生产富含PUFA的结构化脂质。,（3）将PUFA富集于胆甾醇和磷脂中,有人利用选择性脂肪酶将沙丁鱼油和自由脂肪酸中的DHA、EPA通过酯化反应富集于胆固醇中。还有人把多种甾醇有效地与 EPA、g-亚油酸等多种PUFA合成甾醇酯，促进PUFA的稳定性。,应用实例,猪油的脂肪酸结构与人乳脂有一点相似，即棕榈酸主要分布在sn-2位，但猪油的
17、硬脂酸含量过高，影响其熔点和婴儿的吸收；必需脂肪酸含量过低，特别是亚麻酸，且不符合亚油酸与亚麻酸之间的平衡比(515)；不含DHA等。采用1,3位催化专一性脂肪酶作催化剂，以适当配比的游离脂肪酸为酰基供体，改变猪油的1,3位脂肪酸组成来合成结构与人乳脂相似的脂肪。获得较为满意的结果。,在面条专用粉中，可减少面团上出现斑点，改善面带压片或通心粉挤出过程中颜色的稳定性。同时还可以提高面条或通心粉的咬劲，使面条在水煮过程中不粘连、不易断，表面光亮滑爽。这是因为脂肪酶可增加面团晶体结构的热稳定性。因此若过量使用会使布置变得太硬，产生相反效果。,4.4.5.2人造奶油的生产,工业人造奶油的生产主要是在碱
18、性催化剂作用下，通过酯交换，部分增加饱和脂肪酸的量，从而使油脂具有特定的熔融特性。但化学方法反应温度高于100，需要真空或充氮以防止脂肪氧化，脂肪酶可在相对温和的条件下催化油脂间的转酯或酯交换，从而获得质量较好的人造奶油。,4.4.5.3 类可可脂的生产,可可脂是最贵重的油脂之一，具有入口即化的熔融特性，是加工巧克力的重要原料，价格十分昂贵。运用酯交换技术可以生产出可可脂的类似物，传统酯交换工艺采用的是化学方法，常用的催化剂是金属钠或氢氧化钠、无机酸等，会造成反应体系中酰基间的交换与分布的随机性，致使副产品增多。,使用1,3-定向脂肪酶作为催化剂，酰基的迁移与交换则限制在1-位和3-位上，这样
19、就能生产出化学法酯交换所无法得到的特定目标产物。现以棕榈油中间分提物、乌桕脂、茶油等原料，通过酯交换改性技术生产类可可脂的研究取得了很大的进展。,4.4.6在提取维生素E中的应用,植物油脱臭馏分是提取天然维生素E的方法，但其中甘油酯的存在会给后续的高真空蒸馏或分子蒸馏带来困难，影响甾醇的结晶分离和产品质量。国内外一般多采用皂化法和酯交换法来分解并除去甘油酯，然而，皂化是在碱性环境中进行的，酯交换也需加碱催化，维生素E在强碱性条件下易氧化分解，提取率很低。利用脂肪酶催化油脂水解反应来分解其中的甘油酯，则是一种简捷而又经济的方法。,4.4.7在食用油脂精炼中的应用,在食用油脂精炼工艺中，通常采用的
20、脱酸方法是向油中加入碱以中和油中的游离脂肪酸。而在碱炼过程中总是不可避免地要造成中性油、甾醇、生育酚等的损失。近10年来，借助脂肪酶在一定条件下能催化脂肪酸与甘油间的酯化反应，从而把油中的大量游离脂肪酸转变成中性甘油酯。生物精炼技术已应用于高酸值油脂的脱酸。,含多不饱和脂肪酸油脂例如含有二十二碳六烯酸(22：6n-3;DHA)的金枪鱼油和含有C-亚麻酸(18：3n-6GLA)的琉璃苣油已经应用于功能性食品和婴儿食品配料中。含有花生四烯酸(AA)单细胞油也已经用于婴儿食品配料中。这对此类脂肪酸产品开发与品质提出了更高的要求,它们的纯化方法研究已经成为亟需解决的问题。,目前,工业上采用蒸馏和脲包法
21、纯化二十碳五烯酸乙酯。采用蒸馏、脲包、高压液相色谱或银离子交换色谱技术可以对DHA和GLA进行纯化,但此工艺由于其生产成本过高而无法实现工业化生产。因此,更多的研究者转向酶反应技术的研究。,4.4.8功能性油脂分离和纯化,利用酶对多不饱和脂肪酸的反应活性较弱这个性质，可以富集鱼油水解后甘油酯相中的多不饱和脂肪酸，包括EPA和DHA。通过酶水解琉璃苣油可以获得富含GLA（亚麻酸）的油，同样采用这种酶对含有花生四烯酸的单细胞油进行水解也可获得富含花生四烯酸的油。但很难使其含量超过70%，这主要是因为酶对多不饱和脂肪酸酯键也有一定的水解能力。发现酯化过程中酶对脂肪酸的专一性要比在水解过程更明显，利用
22、这个性质，成功地使GLA在脂肪酸中的含量提高到85%，回收率为64%。,选择性酯化纯化多不饱和脂肪酸(PUFA),第一步可用碱性皂化水解，也可用脂酶水解。第二步采用对多不饱和脂肪酸低选择性酶催化游离脂肪酸和月桂醇酯化,这样达到富集多不饱和脂肪酸的目的,后采用分子蒸馏设备分离游离脂肪酸。,例1：金枪鱼油中DHA的纯化方法,第一步是水解金枪鱼油（DHA含量为22%）;第二步，在酶催化下对游离脂肪酸和月桂醇进行选择性酯化反应，最终DHA在游离脂肪酸中的含量可提高到75%，然后通过分离游离脂肪酸进行二次反应可使DHA含量提高到91%，DHA回收率为60%(相对金枪鱼油中所含DHA量)。,例2单细胞油脂
23、中花生四烯酸(AA)的纯化,以含AA25%(W%)的油脂为原料：非选择性酶反应生成的游离脂肪酸。采用C1rugosa酶进行酯化,酯化过程AA几乎没有发生酯化,一次酯化可使游离脂肪酸中AA的含量提高到51%(W%)。由于C.rugosa酶对GLA、二十二碳酸及二十四碳酸的反应活性较弱,因此游离脂肪酸中这些组分的含量也较丰富。,例3琉璃苣油中的(GLA)分离提纯,原料油中含有45%(W%)GLA第一步水解中,使用PseudomonasSP酶,水解率为92%后在Rdelemar酶催化下游离脂肪酸进行选择性酯化，GLA含量到89.5%(W%)，通过进一步纯化,GLA含量可增加至97.3%(W%),经过多步纯化过程,GLA相对原料回收率为44%。,4.4.9在面制品中的应用,在面包专用粉中加入脂肪酶可以得到更好的面团调理功能，使面团发酵的稳定性增加，面包的体积增大，内部结构均匀，质地柔软，包心的颜色更白；在馒头专用粉中，脂肪酶也会起到类似于在面包专用粉中的添加效果，尤其对我国使用老面发酵的情况，脂肪酶可以有效地防止其发酵过度，保证产品质量；,
