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1、微生物(Microorganism)形体微小、结构简单，须借助于光学显微镜或电子显微镜进行观察。病毒(包括噬菌体)；细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体等；真菌：包括酵母菌（单细胞）、霉菌（多细胞）；单细胞的藻类以及原生动物等。,非细胞型微生物,单细胞原核微生物,真核微生物,细菌(bacteria)的细胞形态 1、球菌 单独存在时为圆球形，几个细菌联在一起时其接触面稍为扁平。按其分裂方向和分裂后排列状态，可以分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌。2、杆菌 细胞呈杆状或圆柱状，各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长，短杆菌近似球状，长杆菌近似丝状。
2、一般来说，同一种杆菌其粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。有的杆菌很直，有的稍弯，有的两端截平如炭疽芽孢杆菌，有的略尖，有的半圆。,一、实验目的：1、学习微生物涂片、染色的操作技术，掌握细菌单染色法、革兰氏染色的方法；2、学习并掌握油镜的原理和使用方法。,二、原理：（一）油镜：显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示：能辨别两点之间最小距离D=/（2NA）式中=光波波长 NA=物镜的数值孔径物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，显微镜的分辨力越大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出。我们肉眼所能感受的光波平均长度
3、为0.55m。使用NA为0.65高倍物镜，D=0.55/(2x0.65)=0.42m 使用NA为1.25的油镜，D=0.55/(21.25)=0.22m,高放大倍数高分辨力：40 x高倍镜（NA=0.65）和24x目镜，总放大倍数为960，D=0.42m；100 x的油镜（NA=1.25）和9x目镜，总的放大率为900，D=0.22m。Olympus油镜刻有黑、白双圈，并标有“Oil”字样。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是一层油质，称为油浸系。这种有常选用香柏油(折射率n=1.25，与玻璃相同)，当光线通过玻片后，可直接通过香柏油进入物镜发生折射；如果玻片与物
4、镜之间的介质为空气，称为干燥系，光线在空气介质中因散射而减弱，这样就减低了视野的照明度。,数值孔径:即光线投射到物镜上的最大角度（镜口角）的一半正弦，和玻片与物镜间介质的折射率的乘积。NA=n sin 式中n=介质折射率、=最大入射角的半数，即镜口角的一半数 光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，的理论限度为900，如当光线入射角为1200，其半数的正弦为sin600=0.87。以空气为介质时 NA=10.87=0.87；以水为介质时 NA=1.330.87=1.15;以香柏油为介质时 NA=1.520.87=1.32。,（二）单染色 由于细菌微
5、小，无色透明，未经染色往往不易被识别，因此只有借助于染色法可使细菌着色，与背景形成鲜明对比，便容易在显微镜下观察。细菌单染色的原理一般认为是微生物与各种不同性质的染料具有亲和力而被着色。由于细菌的等电点较低（pH2-5），故在近于中性的环境中，细菌多带负电荷，易与碱性染料（带正电）结合而着色，因此细菌染色我们一般都用碱性苯胺染料如美蓝、碱性复红、结晶紫、沙黄、孔雀绿等。单染色是一种染料使所有细胞都染上相同的颜色，此法简便，适用于菌体一般形态的观察，但不能鉴别细菌，它是染色的基础，可以观察细菌的大小。,（三）革兰氏染色 革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用至今的经典染色法。经革
6、兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和G-两大类。染色机制：与细菌细胞壁的结构和组成有很大关系。G+细菌：肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色，复染后不着色，保持结晶紫的颜色；G-细菌：肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙醇处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精将结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成红色。,肽聚糖,脂蛋白,磷壁酸,外膜,革兰氏染色成败关键：酒精脱色，脱色不够将G-转变为G+，脱色过度将G+变成G-；涂片要均匀、薄；菌龄影响染色，菌龄老、陈旧的细
7、菌培养物，往往G+转变成G-，一般做革兰氏染色用18小时左右的细菌培养物，不要超过24小时，以免影响染色性。,三、实验材料：,1、菌种：模式种 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（37培养20h）；自选种 从土壤分离的细菌菌落任选一种 2、试剂：革氏染液（结晶紫、碘液、95%酒精、蕃红）、生理盐水、香柏油、二甲苯等；3、器材：显微镜、酒精灯、接种环、拭镜纸、载玻片。,四、操作步骤：,1、单染色：涂片干燥、固定（通过火焰数次）染色1-2分钟 水洗脱去多余染液 自然干燥或洗水纸吸干 镜检。2、革兰氏染色：涂片 干燥、固定结晶紫染色2分钟细水冲洗碘液媒染1分钟 细水冲洗95%酒精脱色 15秒 水洗 蕃红溶液复
8、染 1-2分钟 水洗 干燥镜检。,染色操作步骤涂片固定,取菌涂片的无菌操作图解,细水冲洗,结晶紫初染2min,碘液媒染1min,95%酒精脱色 20s,蕃红复染 12min,细水冲洗,细水冲洗,油镜操作规程,1.先用低倍镜和高倍镜观察涂片，待看到目的物后，将其移到视野中央。2.在涂片上滴一滴香柏油，转动换转器使油镜针对通光孔。3.使油镜与香柏油接触，这时油镜头几乎与载玻片相接触，切记不能使用粗调，以免压碎载玻片。4.用细调旋钮慢慢提升镜头高度，直至物像清晰。切勿拧反方向。5.观察完毕后，使镜筒远离载物台。取下载玻片。用擦镜纸擦去镜头上的香柏油：先用干的擦镜纸擦12次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，最后再用干擦镜纸擦1次。擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。擦拭要细心，动作要轻。,五、结果：,绘模式种、自选种镜检油镜视野图（比例、形状准确，注放大倍数，染色特性）,G+(金黄色葡萄球菌),G-（枯草芽孢杆菌）,G-（大肠杆菌）,六、思考：,1、对未知菌进行革兰氏染色，如何保证结果的可靠性？2、为什么说酒精脱色是革兰氏染色的关键步骤？,
