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1、细胞因子概念,细胞因子（Cytokine）是细胞应对各类刺激而分泌的小分子蛋白，它们调控细胞生长与分化、组织的发育与修复等多种生命过程，在天然免疫和获得性免疫中起着重要作用。,细胞因子研究历史,1957年，发现干扰素（IFN）1969年，提出淋巴因子（lymphokine）的概念 1974年，定名细胞因子（cytokine）近年来，细胞因子发展迅猛，现已发现200多种细胞因子，成立专门的细胞因子学会，如国际细胞因子学会（international cytokine society）；创办研究细胞因子的专门杂志，如Cytokine等。人类基因组研究显示，不仅有新成员存在于已有的细胞因子家族中，还
2、会找到全新的家族，尚有多种细胞因子有待发现。,怎样确定一种物质是细胞因子？,从人类基因组发现新细胞因子由于体内含量较高的细胞因子大部分已被克隆化，传统的路线已经难以发现新免疫分子。目前的新细胞因子克隆化策略主要利用反向生物学原理，从人类基因组发现新细胞因子或其受体编码基因。传统生物学策略发现生物活性鉴定细胞因子蛋白克隆基因细胞表型动物模型人体内功能及与疾病关联 反向生物学策略数据库DNA序列 生物信息学蛋白质表达细胞表型动物模型人体内功能及与疾病关联。,筛选潜在的细胞因子的策略,未知蛋白的生物信息学分析：无功能性文章报道或无免疫相关的功能性报道具有潜在的信号肽或被证实为分泌蛋白蛋白氨基酸数目少
3、于300个主要在免疫系统和造血系统中表达,4,获得的基因，ORF克隆连接在真核表达载体,转染293T细胞，检测其分泌表达,正常细胞：未活化时，产生很少；活化后，产量可提高成百上千倍；如活化的淋巴细胞、活化的单核/巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等。,IL-1、IL-6、IL-12、IL-18 和 TNF主要由巨噬细胞产生的细胞因子,细胞因子的来源,肿瘤细胞 如Jurkat细胞(IL-2,3)、骨髓瘤细胞(IL-6)、WEHI-3(IL-3)等。基因工程技术 从工程细胞如大肠杆菌、酵母菌等产生重组细胞因子。,细胞因子的分类,根据产生细胞因子的细胞种类分类：1、淋巴因子(lymp
4、hokines)2、单核因子(monokines)3、非淋巴因子、非单核因子/巨噬细胞产生的细胞因子：基质、血管内皮、成纤维细胞等,根据细胞因子的结构和功能分类,1、白细胞介素(Interleukin,IL)2、集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor,CSF)3、干扰素(Interferon,IFN)4、肿瘤坏死因子(Tumor-Necrosis Factor,TNF)5、趋化因子(Chemokine,CK)6、生长因子(Growth Factor,GF)7、转化生长因子家族（TGF-b),1.白细胞介素(Interleukin,IL),1979年第二届国际淋巴因子专
5、题讨论会上命名的，将由白细胞产生的又在白细胞之间发挥作用的细胞因子统一命名为白细胞介素，正式命名的有IL-1-IL-35。Interleukin 来自inter-leukin，意指白细胞之间信使分子，中文译为白细胞介素。,白细胞介素的分类,IL-1 家族：IL-1/1Ra 18 33IL-2 家族：IL-2 4 7 9 15 21(共用受体链)IL-6 家族IL-6 11 27 30 31(共用gp130受体链)IL-10 家族IL-10 19 20 22 24 26 28A/B 29(结构相似)IL-12 家族 IL-12 23 27 35(均为异源二聚体结构)IL-17家族：IL-17A、
6、B、C、D、E和F1。集落刺激因子 IL-3 1 5 6 11 IL-8（趋化因子）其它IL：IL-13 14 16 32 34,IL-2,1976发现,1979年命名,1983年克隆成功1965年发现混合白细胞培养上清中存在一种可溶性因子，可促进细胞生长，命名为母细胞形成因子（Blastogenic Factor，BF)1976年发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，故称为T细胞生长因子（T cell growth factor，TCGF）1979年统一命名为白细胞介素2（interleukin 2，IL-2）,IL-2别名BF(blastogenic factor);Co
7、stimulator;EDF(eosinophil differentiation factor);KHF(killer cell helper factor);LMF(lymphocyte mitogenic factor);LCM factor(lymphocyte-conditioned medium factor)LPF(lymphocyte proliferation factor);MAF-C I(macrophage-activating factor for cytotoxicity I);PFC-EA(plaque forming cell enhancing factor)
8、;SCIF(secondary cytotoxic T-cell inducing factor);TCGF(T-cell growth factor);TCPA(T colony-promoting activity);TDF(thymocyte differentiation factor);TMF(thymocyte mitogenic factor);TMF(T-cell maturation factor);TMF(T-cell mitogenic factor);TRF-3(T-cell replacing factor-3);TSF(thymocyte stimulating f
9、actor).,1983年Taniguchi从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞中克隆成功IL-2含有133aa，分子量为15.5kDaN端有糖基化修饰三个半胱氨酸：58、105、125位,IL-2主要产生细胞：主要由活化CD4+Th1分泌,CD8+T和NK也能产生T细胞肿瘤细胞系:如人Jurkat和小鼠EL-4T淋巴细胞杂交瘤:FS6-14.13、HT-24A等IL-2受体：CD25()；CDl22()；CDl32(c),IL-2的生物学活性,作用具有沿种系谱向上有约束性，向下无约束性：1、促进活化的T细胞进入S期，维持细胞的增殖，刺激产生：MHCII，IFN-，IL-4、5、6，LT-
10、，CSF。2、促进杀伤细胞分化和效应：CTL，NK，LAK；诱导杀伤细胞：IFN-，TNF-产生，增强CTL穿孔素表达3、直接、间接作用于B细胞：促进增殖分化，Ig分泌4、促进巨噬细胞通过ADCC机制杀伤肿瘤,IL-2主要生物学活性,白细胞介素2超家族:one important family of type I cytokines is the common cytokine receptor chain(c)family,which consists of IL2,IL4,IL7,IL9,IL15 and IL21,and is so named because the receptors
11、 for these cytokines share c(also known as IL2Rand CD132),Yrina Rochman et al.Nature Immunology.2009.9：480-490,2.集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor,CSF),能够刺激多能造血干细胞和不同发育阶段的造血祖细胞增殖分化，并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。根据刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞有不同的命名,G-CSF(粒细胞集落刺激因子),1983年命名,1986年克隆成功.人G-CSF基因位于17号染色体,人类有两种不同的G-CSF DNA
12、,分别编码含207和204个氨基酸的前体蛋白,均有30个氨基酸的先导序列,除了在35位插入了3个氨基酸外,其余序列相同.有5个半胱氨酸36=42,64=74,17游离.来源多种细胞可产生内毒素、TNF-、IL-1、IFN-活化单核/巨噬细胞可产生，刺激成纤维、内皮细胞也可产生，某些肿瘤细胞可产生,生物学活性,主要作用于中性粒细胞谱系造血细胞的增殖、分化和活化对人粒细胞、单核细胞、成纤维、平滑肌细胞等有趋化作用。,G-CSF与临床,1、粒细胞减少症2、肿瘤化疗引起血细胞减少症3、贫血和骨髓发育异常综合症,3.干扰素(Interferon,IFN),具有干扰病毒感染和复制功能的细胞因子。1957年
13、从病毒感染细胞培养中分离到一种生物活性物质，因它可以干扰其它病毒的复制而被命名为干扰素。,IFN-、IFN-均定位9号染色体，单外显子；许多刺激剂可活化基因表达；IFN-、IFN-分子结构有相似之处；成熟的IFN-各亚型有166个氨基酸(IFN-2 165个),高度同源,4个保守的半胱氨酸。成熟的IFN-有166个氨基酸,3个半胱氨酸成熟的IFN-由143个氨基酸组成，以同源双体形式存在，对酸不稳定。,生物学活性,IFN-和IFN-1、抗病毒活性：诱导抗病毒蛋白：2-5A合成酶-催化寡核苷酸PPP-活化RNaseL-降解病毒RNA；蛋白激酶PKR-肽起始因子eIF2磷酸化而灭活，抑制病毒蛋白的
14、合成。2、抗细胞增殖：与抗病毒蛋白合成的机制相似;3、免疫调节：上调巨噬细胞IgGFc受体促进ADCC；活化NK，促进杀伤；诱导MHCI、II类分子表达，增强免疫应答水平。有抗病毒、抗肿瘤的活性，但免疫调节的作用比IFN-/重要的多，有较严格的种属特异性。IFN-1、上调MHCI类、II类分子的表达；2、促进Th1细胞分化；3、激活NK、巨噬细胞；4、抑制Th2细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。,病毒,病毒复制,抑制病 毒复制,信号转导,IFN-a,IFN-诱导蛋白,诱导刺激,胞核,胞核,I型干扰素：抗病毒,10 12 g干扰素能在培养组织中保护一百万个细胞免受一千万个病毒颗粒的感染,IFN与临床
15、：自身免疫病：促炎/抑炎，一些实验表明IFN-通过抑制Th-17的分化，从而调节炎症和自身免疫性疾病。对炎症是一个双向调节作用。肿瘤：直接或间接抑制肿瘤生长，但是对某些肿瘤反而有促进作用。IFN-治疗病毒感染性疾病：如丙肝,4.肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF),1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质，该因子对多种肿瘤细胞系具有细胞毒作用，而且在多种动物模型中可引起肿瘤坏死，将其命名为肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）。1984,TNF的cDNA得以克隆，后来相继克隆了该家族的多个成员，构成了TNF超家族细胞因子。,TNF
16、超家族特征,绝大多数成员为II型膜蛋白；在特异性金属蛋白酶作用下，形成可溶形式活性形式多为同源三聚体；TNF超家族包括TNF,TRAIL,FASL等；此外，尚有一批与TNF序列同源，但缺乏诱导凋亡活性的TNF家族成员。TNF主要有2种：TNF-:巨噬细胞产生；TNF-:又称为淋巴毒素(lymphotoxin-，LT-），主要由活化T细胞产生；TNF-和TNF-共用受体，功能相似。,TNFa具有三条不同的信号通路：细胞凋亡通路NFKB通路JNK信号通路通过不同的信号通路，TNFa可以产生不同的生物学效应。与自身免疫病：与肿瘤：引起肿瘤组织缺氧，血管损伤和血栓形成，诱发局部炎症，促进T细胞、NK细
17、胞和巨噬细胞的细胞毒作用，提高宿主免疫力，抑制肿瘤生长。但是。,粘附,5.趋化因子(Chemokine，CK):能使细胞发生趋化运动的小分子蛋白。,趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动。,1999年国际命名委员会根据CK的结构特征命名依据N端前两个半胱氨酸(Cys)的相对位置不同分为:,Chemokine families Chemokine is derived from Chemoattractant and cytokine,C chemokine receptor(XCR)CC chemokine receptor(CCR)CXC chemokine receptor(CXCR
18、)CX3C chemokine receptor(CX3CR),Chemokine receptors,CK及CKR生物学功能：,CK及CKR在免疫应答中的作用：,Lymph node,Effector T cells,mature DC,1.在白血病中的作用：,抗凋亡,促进凋亡,CK及CKR与临床疾病：,6.生长因子(Growth factor),具有促进不同类型细胞生长效应的细胞因子，如TGF-、FGF、EGF、VEGF、NGF、PDGF等。,VEGF(VEGF-A),VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PlGF(placental growth factor).The VEGF f
19、amily of receptors consists of three protein-tyrosine kinases(VEGFR1,VEGFR2,and VEGFR3)and two non-protein kinase co-receptors(neuropilin-1 and neuropilin-2).These components participate in new blood vessel formation from angioblasts(vasculogenesis)and new blood vessel formation from pre-existing va
20、sculature(angiogenesis).Interaction between VEGFR1 and VEGFR2 or VEGFR2 and VEGFR3 alters receptor tyrosine phosphorylation.,血管内皮生长因子(VEGF),The gene encoding human VEGF consists of eightexons separated by seven introns The first 26 a.a.in VEGF constitute the signaling peptide showing thatVEGF is a s
21、ecreted protein.Alternative splicing of the VEGF gene produces four different isoformsVEGF121,VEGF165,VEGF189,VEGF206VEGF145 and VEGF183 In VEGF secreting cells,the most frequent isoform is VEGF165,ahomodimer with molecular mass 45 kD,7、转化生长因子（TGF-）,TGF-超家族是一组调节细胞生长和分化的蛋白质家族,这个家族至少有25个成员，除了TGF-外还有活化
22、素，抑制素，骨形成蛋白，胶质细胞源性神经营养因子家族等TGF-的命名是根据这种细胞因子能使正常的成纤维细胞的表型发生转化,即从贴壁琼脂中生长。,分子结构和编码基因1985年克隆成功,哺乳动物有:TGF-1,TGF-2,TGF-3,TGF-4四个亚型,前三种为同源二聚体分子Pre-pro-TGF-Pre-pro-TGF-N pro-TGF-TGF-(有活性)TGF-的产生1、机体多种细胞都可分泌非活性状态的TGF-。2、活化的淋巴细胞TGF-水平增高。3、几乎所有肿瘤细胞均可检测到TGF-mRNA。,生物学活性,1、抑制细胞增殖：对大多数细胞的增殖具有抑制作用，因此TGF-具有形态发生、免疫抑制
23、和肿瘤抑制的作用。2、它在肿瘤的转移中又可以发挥促进作用，特别是在EMT中发挥了重要作用。3、对细胞表型的调节：抑制IL-2诱导T细胞表达IL2R，TfR等，抑制IFN诱导黑色素细胞表达MHCII抗原4、促进Treg,Th17细胞的增殖分化。、抑制细胞因子的产生：如TNF/，IFN，IL-4，IL-12,上皮间质变迁（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,EMT是细胞转分化的一种方式。特点：上皮细胞的极性消失-细胞与细胞之间的连接丧失；细胞骨架和细胞器的分布状态发生改变等；细胞表达间质细胞特有的某些分子如波形蛋白（vimentin),上皮细胞的标志分子如
24、E-cadherin则消失;细胞出现迁移和运动能力。EMT的核心过程是细胞极性模式的变迁-上皮细胞的稳定极性模式消失，代之以间质细胞的动态极性模式。,EMT的生物学意义：发育肿瘤器官纤维化等,上皮间质变迁与癌细胞演变,癌症的传统定义是上皮组织的恶性细胞病变。起源于上皮组织的癌细胞从原发上皮细胞的稳定极性模式演变为少数具有迁移能力的细胞才具有的动态极性模式，从而获得了侵袭和转移的能力，此即癌细胞演进的EMT学说。,与EMT相关分子,许多抑癌基因的功能丧失性突变或表达下调与EMT有关,如：APC,CDH1,-catenin，PTEN等,许多生长因子参与了EMT,如EGF,TGF,HGF,FGF等，
25、特别是TGF在EMT中起到了重要作用，在多条通路中都发挥作用,一个新的抑制EMT细胞因子的发现,Part.E-Cadherin redistribution&down-regulation,Sylvia Julien Grille et al.,“The Protein Kinase Akt Induces Epithelial Mesenchymal Transition and Promotes Enhanced Motility and Invasiveness of Squamous Cell Carcinoma Lines,”Cancer Res 63,no.9(May 1,2003
26、):2172-2178.,AKT STABLE,shRNA A549稳转株 迁移能力显著增强,Cltr.B,Cltr.C,Cltr.E,sh3.A,sh3.C,sh3.E,0H,24H,36H,0H,24H,36H,细胞因子受体,细胞因子发挥广泛多样的生物学功能是通过与靶细胞膜表面的受体相结合并将信号传递到细胞内部。因此，了解细胞因子受体的结构和功能对于深入研究细胞因子的生物学功能是必不可少的。从细胞因子结合其受体开始，到某些基因转录的启动，要经历复杂的细胞内分子间的相互作用，这样的作用过程称为细胞因子的信号转导；细胞因子受体都是跨膜蛋白，由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成。,1.I型细胞因子受体
27、家族：（造血因子受体家族）2.型细胞因子受体家族：（干扰素受体家族）3.型细胞因子受体家族：（肿瘤坏死因子受体家族）4.趋化性细胞因子受体（CKR）家族：,1.造血细胞因子受体超家族（I类）,结构特征：是细胞因子受体中最大的一个家族，多数成员属于多亚单位受体，其中一种或两种亚单位多肽负责结合细胞因子膜外区序列结构相似于EpoR,即膜外N端含4个高度保守Cys,近膜侧含1个Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser(WSXWS)的基序,D200,2.IFN受体家族(II类细胞因子受体家族),结构特征：两条肽链组成，胞外区Fn3样结构域由200个氨基酸残基组成，也称D200，并含有4个不连续的半胱氨酸
28、，包括IFN和IL-10受体,3.TNFR超家族,主要包括：TNF、Fas、CD40、神经生长因子受体等结构特征：这类受体富含半胱氨酸，在与细胞因子结合后三聚体化。胞外区有3-5个由40个氨基酸残基组成的重复亚单位；每个重复亚单位含有4-6个保守的半胱氨酸；形成“配体结合区域。TNFR I（P55，CD120a）：胞内同源序列即“死亡结构域”TNFR II（P75，CD120b）不含死亡结构域,L,肿瘤坏死因子受体可发挥免疫调节作用,肿瘤坏死因子受体家族的CD40和FAS具有重要的免疫调节作用:CD40-B细胞，巨噬细胞CD40L，FASL-效应T细胞CD40L+B细胞CD40B细胞增生，Ig
29、类别转换CD40L+巨噬细胞CD40-巨噬细胞分泌TNFFAS+FASL-表达FASL的CTL可清除表达FAS的淋巴细胞，这是一种重要的免疫应答的负反馈调节机制。,4.趋化因子受体（GPCRs，G-protein coupled receptors）属于7次跨膜受体超家族，胞内环状结构与Gi/Go蛋白偶联,CKR分类1、根据结合配体的不同，分为CXCR，CCR，XCR,CX3CR；2、根据特异性不同，分为特异性受体、共享性受体、杂合性受体（DARC：Duffy血型抗原，红细胞趋化因子受体）、孤儿受体、病毒受体等。,CXCR4和CCR5是HIV感染的共受体(Co receptors),2.CXC
30、R4（T细胞）与CCR5（巨噬细胞）是HIV感染靶细胞的共受体。,HIV感染人体细胞的过程,Chem Biol Drug Des 2008;72:97110,（二）细胞因子受体的几个特点1.细胞因子受体共同链,两个或更多细胞因子受体亚单位组成异聚或多聚体形式，包括一特异性配体结合（链，低亲和力受体）和一个参与信号转导链（链，参与高亲和力受体形成和信号转导）。,C,IL-2 受 体,gC突变导致T细胞发育障碍,Cytokine receptors that share gC subunit and their functions.,gp130参与造血因子受体家族高亲和力受体形成和信号转导，不直接
31、参与配体结合,细胞因子受体共用链的意义,节约；细胞因子功能替代；共用链缺失或功能缺陷，将引起严重后果，如IL-2R亚家族的 g 链缺陷，将引起SCID。,2.可溶性细胞因子受体(sCKR),产生方式：大部分为膜受体脱落，如SIL-1R、SIL-2R、sTNFR、sIFNrR、sGM-CSFR、sIL-5R、sIL-6R等小部分为分泌型，如sIL-4R、sG-CSFR、sIL-5R、sIL-6R生物学活性：膜受体正常代谢途径 膜受体相应配体“竞争抑制剂”应用：检测，治疗,sCKR与临床：,检测：sIL-2R：恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染与其他传染性疾病、移植排斥反应等sIL-6R：炎症与自
32、身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤和白血病等sTNFR：炎症与自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤和白血病、骨髓移植等治疗：大多数sCKR与细胞因子结合后阻断细胞因子与膜受体结合，从而抑制细胞因子的生物学活性。应用sCKR为减轻或防止细胞因子造成的病理损害提供了新的治疗途经。,3.细胞因子受体有天然拮抗剂,IL-1受体拮抗剂病毒产生的细胞因子结合蛋白，TNF，IL1,细胞因子受体的信号转导,细胞因子受体的信号转导主要利用2个信号转导途径：JAK(Janus kinase)-STATRasMAPK激酶途径,细胞因子介导的信号转导Cytokine induced signal transduction,细
33、胞因子结构与功能特点,结构：同源性低，小分子蛋白，多为单链，少为双链、三聚体（TNF）、多含糖基量微而活性强（pmol/L）,细胞因子作用是作为细胞之间的信使,细胞因子作用特点：旁分泌或自分泌，瞬时、距离范围小通过与相应受体结合发挥作用细胞因子诱导的受体亚单位聚合可以活化蛋白酪氨酸激酶(JAK),导致转录因子STAT酪氨酸磷酸化而激活靶基因转录多效性、重叠性、拮抗性、协同性、网络性：生理调节、病理反应,89,细胞因子间可相互诱生：IL-1能诱生IFN、IL-1、IL-2、IL-4等，IL-2能诱生TNF、IL-2、LT等。细胞因子可调节细胞因子受体的表达：IL-1、IL-5、IL-6等可促进I
34、L-2受体的表达；IL-1能降低TNF受体的密度，细胞因子与生物活性 之间的相互影响。B细胞和T细胞活化过程中，常需要两种以上细胞 因子的协同作用或彼此调节。,多效性,重叠性（丰裕性）,拮抗性,协同性,细胞因子的作用具有网络性,主要生物学效应,抗感染（细菌和病毒）肿瘤()刺激造血细胞增埴分化免疫细胞的分化免疫调节作用细胞因子佐剂其它：促进血管生成，参与炎症反应、各种细胞的生长和分化,刺激造血,主要在骨髓和胸腺中进行；CSF发挥重要作用。1、造血干/祖细胞：IL-3，SCF。2、髓系细胞：GM-CSF，G-CSF，M-CSF。3、淋巴样干细胞：IL-7。4、单谱系细胞：EPO：Red；TPO，I
35、L-11：P；IL-15：NK。,免疫调节,1、固有免疫：（1）DC：定向迁移（CCL3，4，5，7；CCL19，21）；促成熟（IL-1、TNF-）；促抗原提呈(IFN-)。（2）Mo/M：定向迁移（CCL1-8,12-15）、活化（IFN-，GM-CSF,M-CSF）、促抗原提呈(IFN-)。（3）Neu：定向迁移、活化（CXCL8）。（4）NK：促分化（IL-15）；促杀伤（IL-2,12,15,18）。（5）NKT：促活化（IL-2,12）。（6）T：激活（IL-1，7，12，15）。,非成熟DC：CCR1，2，5，CXCR4，向炎症部位聚集，摄取抗原；成熟DC：CCR4，7，CXCR
36、4，负载抗原,向淋巴组织迁移。,The EMBO Journal(2008),110,CKR在DC迁移和功能成熟中具有不同的表达模式,CXCL8参与Neu的迁移和活化,趋化因子参与免疫细胞在周围免疫器官的定位,趋化因子及其受体在免疫系统的表达和功能,Ye H.Oo et al,Journal of Autoimmunity 34(2010)4554.,（1）B：促增殖、活化、分化：IL-4，5，6，13，BAFF；调控Ig类别转换：IL-4，5等。（2）T：促进T细胞增殖、活化：IL-2,7,18；促分化：IL-12,IFN-:Th0 Th1；IL-4:Th0 Th2；TGF-，IL-6：Th
37、0 Th17；TGF-：Th0 Treg。促CTL杀伤：IL-2，6，IFN-。,2、适应性免疫,Cytokines determine the differentiation and regulate the activation of Th cells,TNFSF部分成员，包括TNF-，LT-，TRAIL,FasL等，杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞或活化T细胞。,细胞因子与临床,细胞因子及受体缺陷细胞因子过高表达可溶性受体水平升高,炎症性细胞因子近年来炎症性细胞因子由于其在介导炎症炎症和许多疾病中的关键作用而备受关注，主要是IL-17、TNF、IFN-、IL-6和IL-1等。,与细胞因子相关的
38、疾病举例：慢阻肺：以中性粒细胞为主的多种炎性细胞活化后释放过量的炎症介质，促进气道反复损失与修复，导致气道重塑，引起狭窄，固定性气流阻塞。如IL-8、9、13、17、TNF、IFN-等。慢性心力衰竭：患者TNF,IL-6，IL-1异常升高，免疫系统的平衡被打破，表现为炎性细胞因子的增加和抗炎性细胞因子相对或绝对不足，使已经存在的血流动力学紊乱进一步恶化，因此抗细胞因子治疗有望成为一种新的治疗手段。抑郁症：抑郁症状在多发性硬化、过敏性疾病、中风及风湿性关节炎等这类非感染性慢性免疫激活性疾病中较为常见。研究发现抑郁症患者血清 IL-6、IL-2、IL-1等，且与抑郁症的严重程度有关。急性肺损伤/急
39、性呼吸窘迫综合症：是在致病因子的作用下发生的过度炎症反应，细胞因子TNF,IL-8，IL-1等在其发生发展中都起了重要的作用。其它如重症肌无力、2型糖尿病、动脉粥样硬化、结核病、骨关节病等都与细胞因子密切相关。,细胞因子的检测,用于判断机体免疫功能，进行疾病辅助诊断，判断病程，预后，评价治疗效果,细胞因子检测常用方法,生物活性检测法(biossay)-检测细胞因子的生物学活性免疫学检测法(immnuossay)-检测细胞因子蛋白质的抗原特性分子生物学检测法-检测细胞因子的mRNA表达,生物活性检测法,增殖实验：应用某一细胞因子能特异刺激或抑制某些指示细胞的增殖,通过3HTdR摄入,MTT,反应
40、待测细胞因子的活性水平;集落形成实验：半固体培养系统,造血因子集落刺激因子诱导干细胞形成某一或某些种类的集落.直接杀伤靶细胞：3HTdR、51Cr释放法抗病毒活性：干扰素抑制病毒致病变的程度,计算样品中IFN的活性单位凋亡实验：各种试剂盒、流式细胞仪趋化实验：琼脂糖中的趋化实验、微孔小室趋化实验迁移、侵袭实验：划痕试验、transwell,细胞增殖常用方法,3H-thymidine incoroperation 法 将PBMC 2106/ml 置於 96-well plate,再加入 RPMI 培养基或添加有 LPS(lipopolysaccharide),Con A,PHA,PWM 等细胞丝
41、裂原的培基。於 37 CO2 培养箱2天後，加入 1 Ci/well 3H-胸腺嘧啶（thymidine），继续培养 8小时后，以 cell harvester 收集细胞于滤纸上，风干后以闪烁计数仪测 3H-thymidine 含量，计算细胞增殖能力。MTT法基本可以替代。Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan(参考图1)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越
42、浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。,Transwell将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。,肿瘤细胞迁移实验 8.0、12.0m膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。肿瘤细胞侵袭实验 8.0、12.0m膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。t
43、ranswell侵袭实验，原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。,免疫学检测法(1),可溶性细胞因子检测:放射免疫测定（RIA）特异Ab包被+待测样品和同位素标记的细胞因子-竟争抑制实验酶联免疫吸附实验（ELISA）双抗体加心法Western Blot检测单个细胞分泌的细胞因子：细胞斑点、酶联斑点,免疫
44、学检测法(2),细胞内和细胞膜上的细胞因子的研究检测单个细胞结合的细胞因子：生物素、碱性磷酸酶、免疫荧光检测细胞内的细胞因子,细胞内的细胞因子的荧光检测,分子生物学检测,Southern BlotNorthern Blot原位杂交RT-PCR,体内功能研究,基因敲除、转基因利用特异性抗体观察细胞因子在体内的生物学作用,细胞因子的应用,在临床治疗：重组细胞因子：抗肿瘤细胞因子：IL-2、IFN促进造血的细胞因子：G-CSF、GM-CSF、EPO、IL-11最近发现细胞因子可以增强化疗药治疗白血病的疗效。阻断和拮抗 IL-1RA，TNF单抗，可溶性TNFR生物佐剂：增强抗原性,C I K细胞制备方
45、法：取患者自体外周血 2 0 ml，分离单个核细胞，置含干扰素、IL-2、抗 CD3单抗的完全 1640培养液中，第 l 0 d 1 3 d细菌霉菌培养阴性收获细胞，洗涤后制备成细胞悬液用于治疗。,细胞因子的临床应用举例,1、重组细胞因子：IFN-治疗肝炎；GM-CSF,G-CSF治疗白细胞减少。2、细胞因子抑制剂：（1）可溶性细胞因子受体,可溶性TNF-受 体治疗RA类风湿性关节炎(RA)；（2）细胞因子抑制物,IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）治疗类风湿关节炎（3）抗细胞因子或细胞因子受体抗体，抗TNF-治疗RA。3.免疫毒素：DAB389-IL-2免疫毒素治疗T细胞淋巴瘤,已批准上市的重
46、组细胞因子药物,IFN 白血病、Kaposi肉瘤、肝炎、癌症、AIDS IFN 慢性肉芽肿、生殖器疣、过敏性皮炎、类风湿关节炎 G-CSF 自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞减少症、再生障碍性贫血 GM-CSF 自身骨髓移植、化疗导致的血细胞减少症、再生障碍性贫血 Epo 慢性肾衰导致贫血、癌症或癌症化疗导致的贫血、失血后贫血 IL-2 癌症、免疫缺陷、疫苗佐剂 IFN 多发性硬化症 IL-11 放化疗所致血小板减少症 SCF 与G-CSF联合应用与外周血干细胞移植 EGF 外用药治疗烧伤、溃疡 bFGF 外用药治疗烧伤、外周神经炎,FDA批准上市的细胞因子抑制剂,美国FDA2001年11月批准上
47、市的IL-1ra（Kineret），治疗类风湿关节炎,治疗：炎症和自身免疫病；T细胞淋巴瘤、白血病；移植排斥等,白喉毒素片段（389aa）IL-2,治疗T细胞淋巴瘤的细胞因子免疫毒素DAB389-IL2结构示意图,我国已批准进入临床的基因治疗项目：P53腺病毒治疗肿瘤（批准上市）IX因子基因治疗血友病 缺失突变腺病毒（H101）治疗肿瘤 VEGF裸DNA治疗梗塞性外周血管病 TK基因治疗恶性脑胶质瘤 IL-2基因瘤苗治疗胃癌,XSCID的IL-2受体链基因治疗（2000年法国报道2例，迄今11例，10例成功）。但2002年发现2例出现白血病,基因均整合至癌基因LMO-2。,Yrina Roch
48、man et al.Nature Immunology.2009.9,Bubble-boy(IL-2R的链缺陷引起SCID),XSCID 基因治疗原理,表达细胞因子VEGF的腺病毒或裸DNA直接体内注射治疗梗塞性血管病,细胞因子佐剂,细胞因子在免疫应答的产生和调节中具有重要作用，可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。近年来，重组质粒表达的细胞因子在核酸疫苗研究领域引起了人们广泛的兴趣与关注。核酸疫苗通常比复制性完整的病原体的免疫原性差，需要多次免疫才能使动物得到有效保护。为了提高这类疫苗的效率，人们尝试了许多方法。正如传统疫苗可通过添加佐剂来增加其免疫作用一样，基因工程疫苗也可通过添加佐剂来达到增
49、强免疫作用的目的。人们最感兴趣之一的便是细胞因子。,1 增强细胞免疫反应的细胞因子 IFN-，IL-2，IL-12，IL-15或IL-18会降低IgGl/IgG2的比例，显示Thl倾向性，同时加强迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity,DTH）和升高CTL反应。2 增强体液免疫反应的细胞因子 IL-4、IL-6和IL-10与在抗HIV、HBV、HSV核酸疫苗联合应用后，均会降低IgG1/IgG2抗体比例，提高DTH水平，加强CTL应答。3 同时增强细胞免疫和体液免疫反应的细胞因子 GM-CSF是另外一种新型的免疫佐剂，能诱导分化、增殖和活化多种免疫活性细胞，它不仅可以刺激巨噬细胞的生成，还可以诱导体液免疫和细胞免疫。IL-2的功能比较广泛，对T细胞和B细胞，NK、巨噬细胞等都有作用，因此IL-2可通过不同作用环节调节和增强DNA免疫效应，发挥佐剂作用。,思考题,1.举例试述细胞因子在临床的应用（2个以上细胞因子）。2.试述细胞因子的结构与功能特点。,
