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1、细胞因子和细胞因子受体Cytokine and Cytokine Receptor,王 露北京大学人类疾病基因研究中心,概述,概念：研究历史：来源：正常细胞、癌细胞、基因工程,1957年发现第一个细胞因子-干扰素，细胞因子以其独特的生物学活性和潜在的临床应用价值，一直受到生命领域的高度关注并成为研究热点。已经发现200余种细胞因子,第一阶段：1957-1970，发现活性，结构不清第二阶段：1970-1985，借助分子生物学技术第三阶段：1985-2000，发现细胞因子系统，生物药开始研发；第四阶段：2003-，发现更多，更深入，以细胞因子及受体为药物靶点取得产业化重大成果。,细胞因子研究历史,
2、淋巴因子,IFN,IL-2,IL命名IFN克隆成功,LI-1,IL3/4/16命名,细胞因子,19571968197219741975197619791981/2198519861988,TNF,sIL-2R,IL-8,IFNa2a/b上市,199219941995199619972000200220032004200520072012,趋化因子,IL-15/TPO,细胞因子信号转导抑制蛋白CISIL-17,CXCR4/CCR5-HIV,IL-18,IL-19,IL-20/21/22,IL-23/24/25/26/27,IL-28/29/,IL-30/31,IL-32-IL38,细胞因子最新事
3、件,本世纪初，呼吸窘迫综合征（SARS)、禽流感、甲流等突发传染病给人类健康造成严重危害，上述疾病的相关病毒使部分感染者病重及死亡的关键机理涉及被称为细胞因子风暴的免疫过程，即：感染引起体液中多种细胞因子大量产生，引起急性呼吸窘迫综合征甚至多器官衰竭。,按照结构特征和命名分类,1、白细胞介素(Interleukin,IL)2、集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor,CSF)3、干扰素(Interferon,IFN)4、肿瘤坏死因子(Tumor-Necrosis Factor,TNF)5、趋化因子(Chemokine,CK)6、生长因子(Growth Factor,GF
4、),按照功能分类,促炎CK:IL1，TNF,IL6，IL12，IL17，IL18，IL 23，IL27，IL32，IL33，MIF抗炎CK:IL4，IL10，IL13，TGF,IL21，IL25，IL35，IL37，IL1R固有免疫CK：TNF，IFN/,IL1，IL6，IL10，IL12，IL15，IL18，IL23，IL27适应免疫CK：IFN，IL2，IL4，IL5，IL10，IL12，IL13，IL17，TGF抗病毒：IFN/,IFN 促T生长：IL2，IL4，IL7，IL9，IL12，IL15，IL21促B生长：IL2，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL13，IL14，I
5、L21 造血因子：IL3，IL7，IL9，IL11，GM-CSF,M-CSF,G-CSF,SCF生长因子：VEGF,FGF,TGF/,EGF,PDGF,SSF,1.白细胞介素(Interleukin,IL),1979年第二届国际淋巴因子专题讨论会上命名的，将由白细胞产生的又在白细胞之间发挥作用的细胞因子统一命名为白细胞介素，正式命名的有IL-1-IL-38。Interleukin 来自inter-leukin，意指白细胞之间信使分子，中文译为白细胞介素。,白细胞介素的分类,IL-1 家族：IL-1/、IL-1R、18、33IL-2 家族：IL-2、4、7、9、15、21(共用受体链)IL-6
6、家族IL-6、11、27、30、31(共用gp130受体链)IL-10 家族IL-10、19、20、22、24、26、28A/B、29(结构相似)IL-12 家族 IL-12、23、27、35、37(均为异源二聚体结构)IL-17家族：IL-17A、B、C、D、E和F集落刺激因子 IL-3、1、5、6、11IL-8（趋化因子）其它IL：IL-13、14、16、32、34,IL-21976发现,1979年命名,1983年从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞中克隆成功1979年统一命名为白细胞介素2（interleukin 2，IL-2）,IL-2含有133aa，分子量为15.5kDaN端有糖
7、基化修饰三个半胱氨酸：58、105、125位IL-2主要产生细胞：主要由活化CD4+Th1分泌,CD8+T和NK也能产生T细胞肿瘤细胞系:如人Jurkat和小鼠EL-4T淋巴细胞杂交瘤等IL-2受体：CD25()；CDl22()；CDl32(c),IL-2别名BF(blastogenic factor);EDF(eosinophil differentiation factor);KHF(killer cell helper factor);LMF(lymphocyte mitogenic factor);LCM factor(lymphocyte-conditioned medium fac
8、tor)LPF(lymphocyte proliferation factor);MAF-C I(macrophage-activating factor for cytotoxicity I);PFC-EA(plaque forming cell enhancing factor);SCIF(secondary cytotoxic T-cell inducing factor);TCGF(T-cell growth factor);TCPA(T colony-promoting activity);TDF(thymocyte differentiation factor);TMF(thymo
9、cyte mitogenic factor);TMF(T-cell maturation factor);TMF(T-cell mitogenic factor);TRF-3(T-cell replacing factor-3);TSF(thymocyte stimulating factor).Costimulator;,IL-2主要生物学活性,IL-2对T细胞的作用,2.集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor,CSF),能够刺激多能造血干细胞和不同发育阶段的造血祖细胞增殖分化，并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。根据刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞
10、有不同的命名。,G-CSF(粒细胞集落刺激因子),1983年命名,1986年克隆成功.人G-CSF基因位于17号染色体,人类有两种不同的G-CSF DNA,分别编码含207和204个蛋白，有5个半胱氨酸36=42,64=74,17游离。来源多种细胞可产生内毒素、TNF-、IL-1、IFN-活化单核/巨噬细胞可产生，刺激成纤维、内皮细胞也可产生，某些肿瘤细胞可产生,生物学活性：主要作用于中性粒细胞谱系造血细胞的增殖、分化和活化。对人粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等有趋化作用。临床应用：粒细胞减少症 肿瘤化疗引起血细胞减少症 贫血和骨髓发育异常综合症,3.干扰素(Interferon,I
11、FN),具有干扰病毒感染和复制功能的细胞因子。1957年从病毒感染细胞培养中分离到一种生物活性物质，因它可以干扰其它病毒的复制而被命名为干扰素。,干扰素的命名,根据来源及对酸的耐受程度，将干扰素分成I 和 II型；I型(IFN-，IFN-)耐酸，pH2活性稳定，其中白细胞产生的称白细胞干扰素，成纤维细胞产生的称成纤维干扰素；II型(IFN-)不耐酸，是抗原或有丝分裂原刺激PBMC产生又叫免疫干扰素；后又将其称为IFN-，IFN-，IFN-；IFN-是异质性的，包括14个亚型，编码基因成串排列在9p23，产物高度同源。,干扰素的产生和作用,I型干扰素抑制IL-1的产生,10 12 g干扰素能在培
12、养组织中保护一百万个细胞免受一千万个病毒颗粒的感染,4.肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF),1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质，该因子对多种肿瘤细胞系具有细胞毒作用，而且在多种动物模型中可引起肿瘤坏死，将其命名为肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）。1984TNF的cDNA克隆成功，后来相继克隆了该家族的多个成员，构成了TNF超家族细胞因子。,TNF超家族特征,绝大多数成员为II型膜蛋白；在特异性金属蛋白酶作用下，形成可溶形式活性形式多为同源三聚体；TNF超家族包括TNF，,TRAIL,FASL等；此外，尚有一批与TNF
13、序列同源，但缺乏诱导凋亡活性的TNF家族成员。TNF-:巨噬细胞产生；TNF-:又称为淋巴毒素(lymphotoxin-，LT-），主要由活化T细胞产生；TNF-和TNF-共用受体，功能相似。,TNF-炎性因子：引起发热、诱导急性期蛋白合成、介导内毒素性休克、诱导细胞凋亡,粘附,5.趋化因子(Chemokine，CK),趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动。,1999年国际命名委员会根据CK的结构特征命名依据N端前两个半胱氨酸(Cys)的相对位置不同分为:,趋化因子的分类,CK及CKR生物学功能：,抗凋亡,促进凋亡,CK及CKR与T细胞：,6.生长因子(Growth factor),具
14、有促进不同类型细胞生长效应的细胞因子，如TGF-、FGF、EGF、VEGF、NGF、PDGF等。,VEGF-AisoformsVEGF121,VEGF165,VEGF189,VEGF206，VEGF145，VEGF183VEGF-B；VEGF-C；VEGF-D。VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3,血管内皮生长因子(VEGF),细胞因子受体,细胞因子发挥生物学功能是通过与靶细胞膜表面的受体结合并将信号传递到细胞内部。因此，了解细胞因子受体的结构和功能对于深入研究细胞因子的生物学功能是必不可少的。从细胞因子结合受体开始，到某些基因转录的启动，要经历复杂的细胞内分子间的相互作用，这样的作用过程
15、称为细胞因子的信号转导；,1.造血细胞因子受体超家族（I类）,结构特征：是细胞因子受体中最大的一个家族，多数成员属于多亚单位受体，其中一种或两种亚单位多肽负责结合细胞因子膜外区序列结构相似于EpoR,即膜外N端含4个高度保守Cys,近膜侧含1个Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser(WSXWS)的基序,D200,2.IFN受体家族(II类细胞因子受体家族),结构特征：两条肽链组成，胞外区Fn3样结构域由200个氨基酸残基组成，也称D200，并含有4个不连续的半胱氨酸，包括IFN和IL-10受体,3.TNFR超家族,主要包括：TNF、Fas、CD40、神经生长因子受体等结构特征：这类受体富含半胱
16、氨酸，在与细胞因子结合后三聚体化。胞外区有3-5个由40个氨基酸残基组成的重复亚单位；每个重复亚单位含有4-6个保守的半胱氨酸；形成“配体结合区域。TNFR I（P55，CD120a）：胞内同源序列即“死亡结构域”TNFR II（P75，CD120b）不含死亡结构域,4.趋化因子受体（GPCRs，G-protein coupled receptors）属于7次跨膜受体超家族，胞内环状结构与Gi/Go蛋白偶联,CKR分类1、根据结合配体的不同，分为CXCR，CCR，XCR,CX3CR；2、根据特异性不同，分为特异性受体、共享性受体、杂合性受体（DARC：Duffy血型抗原，红细胞趋化因子受体）、
17、孤儿受体、病毒受体等。,CXCR4和CCR5是HIV感染的共受体,CXCR4与CCR5是HIV感染靶细胞的共受体,HIV世界第一治愈人蒂莫西雷-布朗，一名居住在德国柏林的美国翻译。1995年：血液中携带HIV病毒。2006年：白血病。化疗/干细胞移植。主治医生迪尔同时思考着艾滋病治愈的可能。HIV/CD4/CCR5 迪尔的设想,为了实现这样的天方夜谭，迪尔医生在全世界找到了232名志愿者，他们的骨髓可以与布朗匹配。随后，对他们进行基因检测，试图寻找特定的突变。迪尔医生的实验室将支付这笔40美金/人的检测费用。寻找骨髓源的过程中，上天对布朗表现出更多的是仁慈。第61位捐献者带来了福音。找到合适的
18、骨髓源后，他在医院中接受了两次骨髓干细胞移植手术。这一次，布朗的命运豁然转折，使他成为了千万分之一的幸运儿。移植的干细胞在布朗体内发挥了应有的作用，源源不断地产生新细胞，重建起具有CCR5受体缺失的免疫系统。这意味着，HIV病毒在他体内渐渐走投无路。2010年，布朗体内的HIV病毒已被彻底清除，他成为了艾滋病根治的第一人。这是人类战胜艾滋病的首个案例，打破了“艾滋病不可治愈”的神话。尽管这项成功难以复制，它仍为艾滋病研究带来了希望和信心。布朗也因此成为了医学界的明星人物。,（二）细胞因子受体的几个特点1.细胞因子受体共用链 两个或更多细胞因子受体亚单位组成异聚或多聚体形式，包括特异性配体结合链
19、和一个参与信号转导链。,IL-2受体,IL-2受体家族,gp130参与造血因子受体家族高亲和力受体形成和信号转导，不直接参与配体结合,细胞因子受体共用链的意义,节约；细胞因子功能替代；共用链缺失或功能缺陷，将引起严重后果，如IL-2R亚家族的 g 链缺陷，将引起SCID。,gC突变导致T细胞发育障碍,2.可溶性细胞因子受体(sCKR),产生方式：大部分为膜受体脱落，如SIL-1R、SIL-2R、sTNFR、sIFNrR、sGM-CSFR、sIL-5R、sIL-6R等小部分为分泌型，如sIL-4R、sG-CSFR、sIL-5R、sIL-6R生物学活性：膜受体正常代谢途径 膜受体相应配体“竞争抑制
20、剂”,sCKR与临床：,检测：sIL-2R：恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染与其他传染性疾病、移植排斥反应等sIL-6R：炎症与自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤和白血病等sTNFR：炎症与自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤和白血病、骨髓移植等治疗：大多数sCKR与细胞因子结合后阻断细胞因子与膜受体结合，从而抑制细胞因子的生物学活性。应用sCKR为减轻或防止细胞因子造成的病理损害提供了新的治疗途经。,细胞因子结构与功能特点,结构：同源性低，小分子蛋白，多为单链，少为双链、三聚体（TNF）、多含糖基量微而活性强（pmol/L）,细胞因子作用特点,旁分泌或自分泌，瞬时、距离范围小通过与相应受体结合发
21、挥作用细胞因子诱导的受体亚单位聚合可以活化蛋白酪氨酸激酶(JAK),导致转录因子STAT酪氨酸磷酸化而激活靶基因转录多效性、重叠性、拮抗性、协同性、网络性：生理调节、病理反应,59,细胞因子间可相互诱生：IL-1能诱生IFN、IL-1、IL-2、IL-4等，IL-2能诱生TNF、IL-2、LT等。细胞因子可调节细胞因子受体的表达：IL-1、IL-5、IL-6等可促进IL-2受体的表达；IL-1能降低TNF受体的密度。B细胞和T细胞活化过程中，常需要两种以上细胞 因子的协同作用或彼此调节。,多效性,重叠性（丰裕性）,协同性,拮抗性,细胞因子的作用具有网络性,细胞因子的免疫学功能,调控免疫细胞的发
22、育、分化和功能 中枢免疫器官：IL7，SCF,CXCL12,IL3，MCSF,MCSF 外周免疫器官：IL4，IL5，IL6，IL13-B细胞 IL2，IL7，IL18-T细胞,Treg,Th0,Th17,Th2,Th1,TGFIL10,TGF,IL-10,IFN，IL2IL12,IL13,IL4,IL6/IL1TGF,IFN,IL2,IL4,IL36,IL22,IL17,IL36,IL22,细胞免疫,体液免疫,固有免疫,免疫负调控,调节机体的免疫应答,抗感染免疫 抗菌免疫 抗病毒免疫抗肿瘤作用诱导细胞凋亡,细胞因子与疾病,细胞因子风暴（cytokine storm)/高细胞因子血症,免疫应答
23、,分泌大量细胞因子,免疫细胞,刺激,调控,异常、失控,迅速大量产生细胞因子（TNF,IL1,6，12，8，18等,异常免疫应答，全身炎症反应综合征多器官功能障碍综合征，ARDS,感染,细胞因子与炎症：炎症是生命个体其组织与细胞对损伤性因素所产生的防御反应。引起炎症的因素多种多样，局部的炎症发应有利于机体清除致病因子，严重的炎症可危及生命。炎症反应是典型的多细胞多因子共同参与的过程。促进和抑制炎症的发生发展是免疫系统的固有功能，代表机体清除异己，对抗损伤及进行修复的过程。免疫系统参与炎症的发生与平息过程主要是通过细胞因子介导的。抗炎与促炎因子,细胞因子致热与炎症病理损伤TNF最为突出,作用多效应
24、，参与天然免疫和适应免疫。IL17：促进多种细胞因子的释放和招募中性粒细胞，与多种细胞因子协同放大炎症反应，具有双向调节作用。IL-1:是促炎反应细胞因子，主要参与抗感染免疫。IL-6：是炎症网络的关键组分，具有抗炎抑炎双重作用。IL23:诱导TH17细胞分化，和促进IL17的分泌。也具有双向调节作用。IL-2：维持Treg功能，抑制TH17分化,H5N1病毒感染,固有免疫与禽流感,肿瘤的发生与逃逸 骨髓瘤细胞表面高表达IL6R并分泌大量IL6心脏粘液瘤、浆细胞瘤、子宫颈癌及膀胱癌均异常分泌IL6 IL1可刺激急慢性髓样白血病细胞、浆细胞和卵巢癌细胞生长 多种肿瘤细胞分泌的TGFB、IL-10
25、可抑制机体的免疫功能，有助于肿瘤逃逸免疫系统的监控。,免疫系统相关疾病：超敏反应：自身免疫病免疫缺陷病器官移植排斥反应,细胞因子与疾病的治疗,细胞因子直接治疗细胞因子拮抗治疗,已上市的细胞因子重组药物,已上市细胞因子抑制剂,细胞因子及受体药物研发及应用,IL:IL-2:IL-11；IL-12；IL-1Ra干扰素：IFN-a；IFN-r集落刺激因子：GM-CSF;G-CSF;M-CSF；EPO细胞因子及受体为靶点：FDA批准的单抗有42种，针对细胞因子与受体的有8种,如针对VEGF、EGFR、TNF、IL12/23、IL-6、IL-17a等,细胞因子的临床应用举例,1、重组细胞因子：IFN-治疗
26、肝炎、G-CSF治疗白细胞减少、多种细胞因子用于肿瘤病人的细胞治疗。2、细胞因子抑制剂：（1）IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）治疗类风湿关节炎（2）抗TNF-抗体治疗RA。TNFa受体和Fc融合蛋白：依那西普：84.06亿美元（2012）抗TNFa单抗：英利昔61.39亿；阿达木92.65亿；戈利木6.07亿；塞妥珠6.06亿。3.免疫毒素：DAB389-IL-2免疫毒素治疗T细胞淋巴瘤,美国FDA2001年11月批准上市的IL-1ra（Kineret），治疗类风湿关节炎,治疗：炎症和自身免疫病；T细胞淋巴瘤、白血病；移植排斥等,白喉毒素片段（389aa）IL-2,治疗T细胞淋巴瘤的细胞因子
27、免疫毒素DAB389-IL2结构示意图,Bubble-boy(IL-2R的链缺陷引起SCID),XSCID 基因治疗原理,表达细胞因子VEGF的腺病毒或裸DNA直接体内注射治疗梗塞性血管病,细胞因子检测常用方法,生物活性检测法(biossay)-检测细胞因子的生物学活性免疫学检测法(immnuossay)-检测细胞因子蛋白质的抗原特性分子生物学检测法-检测细胞因子的mRNA表达芯片检测：基因、mRNA、蛋白水平,生物活性检测法,增殖实验：应用某一细胞因子能特异刺激或抑制某些指示细胞的增殖,通过3HTdR摄入,MTT,反应待测细胞因子的活性水平;集落形成实验：半固体培养系统,造血因子集落刺激因子
28、诱导干细胞形成某一或某些种类的集落.直接杀伤靶细胞：3HTdR、51Cr释放法抗病毒活性：干扰素抑制病毒致病变的程度,计算样品中IFN的活性单位凋亡实验：各种试剂盒、流式细胞仪趋化实验：琼脂糖中的趋化实验、微孔小室趋化实验迁移、侵袭实验：划痕试验、transwell,免疫学检测法,放射免疫测定（RIA）：特异Ab包被+待测样品和同位素标记的细胞因子-竟争抑制实验酶联免疫吸附实验（ELISA）双抗体加心法Western Blot检测单个细胞分泌的细胞因子：细胞斑点、酶联斑点,分子生物学检测,Southern BlotNorthern Blot原位杂交RT-PCR,体内功能研究,基因敲除、转基因利
29、用特异性抗体观察细胞因子在体内的生物学作用,发展趋势和展望,利用系统生物学破解复杂细胞因子调节网络作用机制；新型细胞因子还会不断发现：天然细胞因子发现（反向生物学）；已知因子改良；重组细胞因子的创制。细胞因子相关药物开发细胞因子与疾病的因果关系,一个新的细胞因子CTRP4的发现与研究,立题背景,人类基因组计划大量功能未知的新基因被陆续克隆并得到鉴定；功能基因组学；以新基因功能探索作为疾病研究和治疗切入点；反向生物学策略；新基因高通量平台筛选；新细胞因子的筛选和鉴定；,筛选潜在的细胞因子的策略,未知蛋白的生物信息学分析,94,获得的基因，ORF克隆连接在真核表达载体,基因筛选平台,功能研究、应用
30、探讨,CTRP4简介,C1q/TNF related protein4(homo sapiens)NM_031909.2 Located on11P11 1436bp 2 exons/329 amino acids Predicted molecular weight 35.26KD PI:8.38,CTRP4简介,CTRP4简介,真核表达质粒构建及表达效果验证,双荧光素酶报告基因筛选,我们得到了一个具有典型信号肽结构，可以活化NF-kappaB炎症信号通路的新基因。下一步的工作？,验证分泌功能研究（体内体外）阐明机制,CTRP4 与 NF-kappaB信号通路的调节,CTRP4 与 NF-k
31、appaB信号通路的调节,TNF-alpha level,EMSA,HepG2 cells,CTRP4对下游靶基因影响的筛查,HepG2 cells,CTRP4 与IL6/STAT3信号通路的调节,IL6 Expression：,STAT3 Phosphorylation:,HepG2,IL6可被CTRP4剂量依赖性的上调,IL6 Level：,HepG2,HepG2 Cell lysate,HepG2 Cultural supernatant,N-terminal sequencing,CTRP4的分泌验证,CTRP4的原核表达质粒构建及原核蛋白纯化制备,rhCTRP4对于NF-kappaB
32、信号通路的调节活性,HepG2,rhCTRP4对于IL6/STAT3通路的调节作用,HepG2,rhCTRP4 发挥功能的动力学特征,剂量依赖性,时间依赖性,IL6,剂量依赖性,时间依赖性,TNF-alpha,rhCTRP4对肿瘤细胞增殖能力的影响,HepG2,补体C1q分子的结构,Trends Immunol.2004,25(10):551-561,17,CTRP4和补体C1q分子之间C1Q球状结构域的比较,C1Q球状结构域中完全匹配氨基酸位点主要集中在疏水性氨基酸：丙氨酸（A）、苯丙氨酸（F）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）、甘氨酸（G）等,18,C1Q球状结构域的配体谱,ICs、IgG、IgM and-amyloid peptide,CRP、SAP and PTX3Fibronectin,gC1Q domain,Viral ptoteins and LPS,Apoptotic cell、platelets,20,CTRP4,病原体的清除：LPS、virus,清除凋亡细胞,血凝,脂肪代谢与肥胖,免疫细胞调节,36,炎症与肿瘤,思考题：1、试述细胞因子及其受体未来发展的趋势和展望2、试述细胞因子与哪些疾病的发生密切相关,
