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1、1,课程安排,2,3,4,动物细胞工程,动物细胞工程，是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计，进行在细胞水平上的遗传操作,从而获得新型生物。,5,动物细胞工程常用技术,动物细胞培养技术动物细胞融合技术 单克隆抗体技术胚胎移植技术细胞核移植技术,6,动物细胞培养,细胞培养是指从动物活体中取出小块组织分离出细胞，在模拟机体内的生理环境条件下，进行培养，使之继续生存、生长、增殖。原代培养传代培养永久细胞系,7,细胞培养在水产业的应用,鱼类病毒学：病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备鱼类细胞毒理学：评价样品的细胞毒性等水产基础理论鱼类免疫学鱼类遗传学,8,本实验课的目的,培养实验的思维
2、，提高实验技能，锻炼动手能力。掌握无菌操作，养成规范的实验室工作习惯。为将来适应多种领域的工作打基础。,9,鱼类细胞培养的基本条件,温度 温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。适宜的温度：25(温带鱼)、30(热带鱼)、15(寒带鱼)、37(水生哺乳动物)。,10,2.pH 过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。用 NaHCO3 和 Hepes 调节培养液的pH至7.4左右。,鱼类细胞培养的基本条件,11,渗透压 细胞膜调节渗透压的能力是有限的。需用平衡盐
3、溶液配制各种试剂。常用的平衡盐溶液：PBS：磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution）D-Hanks,鱼类细胞培养的基本条件,12,营养物 细胞培养基：培养基中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。常用培养基：MEM、M199、L-15 等动物细胞离体培养常常需要血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。小牛血清；胎牛血清。,鱼类细胞培养的基本条件,13,支持物 大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃或塑料培养瓶等作为支持物。气体交换 CO2培养箱,调节CO2的比例为5%。去离子水/三次蒸馏水,鱼类细胞培养的基本条件,14,无菌条件 体外
4、细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养，但环境中（如空气）有各种其他微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养最基本的条件。,鱼类细胞培养的基本条件,超净工作台,15,实验室仪器设备,实验室条件：干燥、紫外灯 仪器设备：高压灭菌锅:用于高压灭菌干燥箱:用于干燥超净工作台:用于无菌操作 玻璃三蒸水器:用于制三蒸馏水恒温生化培养箱:用于恒温培养细胞倒置生物显微镜:用于观察细胞生长液氮罐：用于细胞长期保存,16,考核方法,实验报告（论文格式）一.目的与意义 二.材料与方法三.实验结果四.讨论（问题经验体会）要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。,17,修读要求,1无菌操作，严格规
5、范操作；2实验是连续性的，需要每天来观察和处理细胞；3.每天来做实验的时间与老师和研究生协商，各组时间要相对集中和固定。,18,实验一&二 思考题,培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，不能高压灭菌？生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜色？为什么？为什么要培养基中需加入L-谷氨酰胺？为什么复苏细胞时，要迅速解冻？,19,实验五 染色体制备,每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。,20,一、准备细胞接种细胞：T 75cm2 瓶
6、子 1个培养24 h换10mL新鲜medium和0.1mL秋水仙素（1g/L）培养13-15h 消化细胞，1000rpm离心，5分钟，收集沉淀细胞加2 mL PBS混匀细胞将细胞悬液移到T 75cm2的培养瓶内,操作步骤,21,慢慢加10mL双蒸水（4）室温孵育10min慢慢加10mL现配的GAA固定液（冰醋酸：甲醇1：3）室温放置10min 移到一个离心管，1000 rpm离心，10min弃去上清，留约 2mL加3mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞1000rpm离心，5min弃去上清，留约 0.5mL,22,加0.5mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加4mL新鲜固定液，轻轻混匀孵育 5分钟10
7、00 rpm离心，5分钟弃去 4.8mL 上清，仅留 0.2 mL加1-1.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀二、清洁玻片6-8个干净的玻片，浸泡在95%乙醇里烘干浸泡在冰水里至少30 min,23,三、准备玻片和染色用滴管吸取来自于步骤1-21的细胞悬液0.2mL 滴在湿玻片上火焰上拖动，固定2-3次放在预热的切片烘干机上，15 min（蒸发液体）把装有1N HCl的染色缸，浸入60水浴中加热，把玻片插入培育 10min倾去HCl溶液用双蒸水清洗玻片2次空气干燥,24,将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中（现稀释的1：25）孵育 15 min用双蒸水冲洗玻片2-3次，除去残液空气干燥显微
8、镜下观察计数,25,实验六 细胞冻存,细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。,26,冻存原理,细胞冻存时向培养基中加入保护剂-终浓度5%-15%的二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻
9、速度开始为-1-2/min，当温度低于-25时可加速，到-80之后可直接投入液氮内（-196）。,27,操作步骤,冻存2个75cm2培养瓶里的细胞，取68个 1.5mL的冻存管。如果每个冻存管需要装1 mL的细胞悬浮液，需要配68mL的冻存液。在离心管中依次加入：DMSO 0.6mL,生长培养基 1.8mL，FBS 0.6mL轻吹打混匀，立即放入冰里；另在收集消化好的细胞的离心管里加入培养液 3mL,轻轻吹打使细胞均匀悬浮。,28,吸取细胞悬液，轻轻加入装有冻存液的离心管内。注意从底部向上缓慢拖着滴加，边加边转动离心管，使细胞均匀分布冻存液中。将细胞悬液分装在6个冻存管中，各管加1mL。盖上冻存管盖子，用膜封口，作好标记。在装有异丙醇的降温盒中，放装有细胞的冻存管，加盖后盒子放入-80过夜；盒子转移到液氮内，进行登记。,
