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1、细胞培养（cell culture),细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。即：从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。,细胞培养（cell culture)是指用机械或化学的方法将组织分散成单个细胞而进行的培养。,组织培养（tissue culture)是指把活体的组织取出分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。其特点是：组织不失散，细胞保持原有的组织关系。,器官培养（organ culture）是将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特
2、征的培养。其特点是：培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1年。,细胞培养常用术语,原代培养（primary culture）：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。传代培养（passage culture）：将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代培养。注：传代（passage，subculture）,细胞系（cell line）：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物。克隆（clone）：指单个细
3、胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。,生物安全柜,超净工作台,细胞培养的设施-培养室,漳州校区细胞实验课使用的细胞培养间.,水浴锅,高压灭菌锅,培养瓶,培养皿,培养板,CO2 培养箱,倒置显微镜,普通显微镜,培养基,培养基,血清,胰酶,双抗(Penicillin-Streptomycin),细胞培养基主要成分,水 糖 氨基酸 维生素 无机离子和微量元素 促生长因子,常见的商品化细胞培养基有:DMEM、MEM、PRMI-1640、M199、Hams/F12等,1、血清的种类 胎牛血清：剖腹产的胎牛 牛血清 新生牛血清：出生24h之内的新生牛 小牛血清：出生1030d的小牛（人血清、马血
4、清、羊血清、鸡血清）2、血清的主要成分及主要作用 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长活性是达到生理平衡的。,血 清,血清的主要作用,提供基本营养物质 提供贴壁和扩展因子（FN、LN）提供激素及各种生长因子（FGF、EGF、PDGF)提供结合蛋白 对培养中的细胞提供某些保护作用,血清的使用与储存,使用前的处理 56灭活30min 去除补体(可促进细胞溶 解)成分,储存条件 灭活后分装成小包装（10mL、20mL、50mL），20 储存；使用前4 融化。使用浓度 一般为220，最常用的是10。,影响细胞生
5、长的因素-温度,一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度3738，温度过高或过低都会影响到细胞的生长。,温度对细胞生长的影响,二氧化碳（CO2）,大多数细胞适于在pH 7.27.4条件下生长，低于pH 6.8或高于pH 7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。动物细胞培养要求有5%的CO2，这是为了维持培养基的pH稳定。因为培养基中使用的是HCO3-CO32-缓冲对，环境中稳定的CO2可以保持培养基处在pH7左右。羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。,培养细胞的生长方式和类型,粘附型细胞：
6、附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞。如：成纤维细胞、心肌与平滑肌细胞、表皮细胞、骨与软骨细胞、肿瘤细胞悬浮型细胞：不必附着于固相支持物表面，而 在悬浮状态下即可生长的细胞。如：血、脾及骨髓培养的细胞及某些癌细胞,培养细胞的生长特点,粘附并伸展 是大多数体外培养细胞的基本生长特点。细胞在接种后很快便可见到细胞伸出伪足附着，与支持物形成一些接触点，接着细胞逐渐呈扁平或放射状伸展，逐渐形成上皮型或成纤维型或其他类型生长。密度依赖性 细胞接种密度过高或过低都会影响细胞的生长、增殖。当细胞粘附生长、融合成单层时，细胞变得较为拥挤，而扁平形状的程度减少，与培养基的接触面减少，同时，培养基中的营养物逐
7、渐消耗，细胞分裂减弱，增殖减慢。,培养细胞的污染,Amphotericin B（两性霉素）,pen/strep（双抗）,培养细胞的污染,Plasmocin,Amphotericin B（两性霉素）,实验七、细胞培养基配制与过滤除菌,实验目的：熟练掌握培养基(DMEM)的配制及过滤除菌的方法实验原理：组织培养使用的培养基其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。L谷氨酰胺在细胞培养时是必须的，脱掉氨基后，L谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在高压灭菌后被大幅降解而产生大量毒性氨,对细胞有毒性。因而含有L谷氨酰胺的培养基不能用高压灭菌的
8、方式除菌。一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH 的缓冲系统，由于NaHCO3容易分解为二氧化碳，很不稳定，因而含有NaCO3的培养基也不能用高压灭菌的方式除菌。市售培养基可分为两种：一是可进行高压灭菌的培养基，这类培养基不含L谷氨酰胺和NaCO3，须灭菌后再添加L谷氨酰胺和NaCO3。另一种是含有L谷氨酰胺，配制的同时在添加NaCO3，这类培养基不能用高压灭菌德的方式除菌，只能采用过虑除菌的方式。,实验材料,材料：1 000 ml、250ml烧杯、100ml、250 ml蓝盖瓶，15ml,50ml 塑料离心管、022 m的微孔滤膜、50ml一次性注射器，超纯水，小牛血清，干
9、粉合成培养基(DMEM)，双抗（青霉素-链霉素），NaHC03。,实验步骤,DMEM培养基的配制 1 称量一定量的DMEM干粉，倒入1000ml烧杯中，加入950ml 去离子水，用磁力搅拌至充分溶解，然后加入适量NaHCO3，溶解后先加入10ml 双抗（100unit青霉素,100ug/ml链霉素，最后加 水1000ml，分装到4个250ml烧杯中。,2.超净工作台预先紫外照射至少20min,关掉紫外灯，通风2-3min,戴上乳胶手套，喷酒精消毒。,用酒精喷软纸将超净工作台平台及工具擦拭干净。,3.将上面分装的250ml烧杯放入超净工作台，在超净工作台中用镊子取出过0.22m过滤 器，放在 2
10、50ml蓝盖瓶瓶口。取20ml一次性注射器吸取一定量的 培养基，通过0.22m过滤器注入250ml蓝盖瓶中。过滤全部结束后，将蓝盖瓶盖紧。贴上标签。4冰箱保存。,取20ml一次性注射器吸取一定量的 培养基，通过0.22m过滤器注入250ml蓝盖瓶中。过滤全部结束后，将蓝盖瓶盖紧。贴上标签。4冰箱保存。,4.标签标记方法：,作业：配制细胞培养基时为什么要添加NaHCO3?,一.实验目的 1.了解相差显微镜的基本原理和结构特点。2.比较活细胞与固定后细胞的形态差异。,实验八 活细胞观察及相差显微镜的使用,人的眼睛只在光的波长(颜色)和振幅(亮度)变化时才能观察到被检的物体，而活细胞或末经染色标本多
11、为无色透明，当光波被通过时，其波长和振幅并没发生什么变化，所以无法辨认。为了观察活细胞的显微结构，就需要使用相差显微镜。相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。,二.实验原理 细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置-环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察
12、到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。,三、实验程序(一)相差显微镜的使用 1.相差显微镜的装置 取下普通显微镜的聚光器，换上带有环状光相的转盘聚光器，并将标示孔指0(即明视野);取下普通物镜，装上相差物镜。2.调焦和调光 用普通低倍物镜在明视野中观察，当发现目标后，把观察的目的物移到视野的中央。观察透明物体时要缩小光栏，当用相差物镜在明视野对好焦点后，换上相应的相差物镜，例如20X,40 x相差物镜分别用ph1、ph2标示孔的光栏，并充分开大孔径光栏。,3.中心调节（合轴调节）拨出目镜，插入中心望远镜，用左手固定其外筒，一边眼看望远镜，一边用右手转动
13、望远镜内筒使其升降，对准焦点后就能看到环状光栏的亮环和相板的黑环。此时可将望远镜固定，微微转动聚光器两侧的调节钮，使两者完全重合。如果亮环和黑环大小一不致，可升降聚光器便之一致，如果升降聚光器仍不能矫正亮环和黑环一致的话，那就是载、盖玻片过厚的缘故。换用不同物镜要同时更换相对应的环状光栏，并重新合轴。,(二)动物活细胞的相差显微镜观察 观察蛙肝细胞装片 1.用镊子和解剖针，把蛙的肝组织小块放在载玻片上，滴上生理盐水，分离出游离肝细胞。在相差显微镜下，可见折射率较高的大的球形细胞核，内含折射率更高的小颗粒 核仁。在细胞核周围还可见到许多暗白的小颗粒即为线粒体。细胞质中还有许多大小不等明亮的细胞质颗粒。2.取一小块肝组织，放入1.5ml离心管中，生理盐水洗1次，去除上清液，用眼科剪剪碎肝组织至糊状，生理盐水洗1遍，3000rpm离心2min去上清，加入500微升胰蛋白酶，37温育10-20min，其间用1ml枪头吹打2-3次。3.加入500微升生理盐水后3000rpm离心2min，去上清，用200微升生理盐水悬浮沉淀，取50微升滴加在载玻片上，滴加一滴生理盐水，盖上盖玻片后观察。四.思考题 1.简述相差显微镜与普通光学显微镜的差别。2.描述蛙肝细胞的形态特点。,
