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1、一、立题依据,1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus-1,HSV-1)引起的角膜感染,称为单纯疱疹病毒性角膜基质炎(herpes stromal keratitis,HSK)。复发性HSK中有20%发展为致盲性的角膜基质炎,是发达国家角膜盲的最常见原因。,一、立题依据,1、目前研究的HSK主要发病机制：大多数研究结果提示,CD4+T细胞介导了单纯疱疹病毒性角膜基质炎,进一步的研究发现,辅助性T细胞1型(T help cell 1，Th1)CD4+细胞起着更加特异性的作用。（下图）,一、立题依据,IL-17A又称IL-17IL-17是致炎细胞因子,促进T 细胞的激活刺激成纤维
2、细胞、内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞,IL-1、IL-6、TNF-、金属蛋白酶和化学增活素,导致炎症的发生,2、IL-17细胞因子,一、立题依据,3、IL-17细胞因子与自身免疫性疾病 IL-17在自身免疫反应中的重要参与已经在动物模型中证实:自身免疫紊乱(胶原介导的关节炎Collogen2induced arthritis,CIA)和实验性自身免疫性脑炎(Experimental autoimmune encephalitis,EAE)、类风湿性关节炎（RA）和多发性硬化（MS 的动物模型以及接触性过敏反应、迟发型超敏反应等变态反应)在IL-17 缺陷的小鼠体内被抑制。,一、立题依据,已有实验
3、研究证明IL-17在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、血管炎、银屑病、多发性硬化、肾病综合征、克罗恩病和溃疡性结肠炎等免疫性疾病中的表达量与病程病情关系密切。HSK已被证明是一种免疫病理性疾病，所以IL-17可能与HSK的发病存在着一定联系。,一、立题依据,4、IL-17细胞因子与HSK 在J.M.等人的实验研究中表明，在HSK患者的角膜中IL-17mRNA明显表达，说明Th17分泌的IL-17在HSK患者的角膜中有表达。这可能表明了IL-17在HSK的发病机制中有着重要的作用。,一、立题依据,最近有实验发现缺乏TNF-会阻止角膜炎的发展。这说明Th1细胞分泌的TNF-在HSK中有着促进炎症反应
4、的作用。用抗IL-6抗体治疗HSK能明显减轻HSK的角膜损伤程度并且显著抑制HSK的复发。IL-6的表达水平与小鼠感染角膜炎的严重程度有关，IL-6参加了HSK的局部炎性反应。这说明Th2细胞分泌的IL-6对HSK的炎症反应有促进作用。,一、立题依据,IL-17,促进,IL-6、TNF-,IL-6、TNF-,HSK炎症,促进,综上所述，IL-17也可能促进了HSK炎症的发展。,一、立题依据,5、IL-17细胞因子与病毒感染的关系 研究者用Theilers murine encephalom-yelitis virus，TMEV）感染小鼠，诱导神经脱髓鞘性病变。病变小鼠Th17细胞体外增殖活性及
5、其产生IL-17水平明显升高。IL-17不仅促进IL-6、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等炎症因子的合成，还能抑制病毒感染细胞的凋亡，且该过程可被抗IL-17抗体所阻断。,一、立题依据,中和IL-17的活性可阻止上述免疫病理反应，降低淋巴细胞向中枢神经系统的浸润，控制病变的进展。综上所述，已有的研究说明了IL-17在HSK过程中有表达，但其在HSK炎症过程中的具体作用还有待进一步研究。,二、研究目标,研究IL-17在单纯疱疹病毒性角膜基质炎中的 作用。,三、研究内容,1、建立小鼠单纯疱疹病毒性角膜基质炎（HSK）模型。2、采用免疫组织化学方法检测HSK小鼠角膜中IL-17的表达和组织学分布
6、。3、使用抗IL-17单抗阻断IL-17后在HSK中的作用，观察对HSK的影响，并探讨IL-17在HSK中的作用机制。,四、拟解决关键问题,抗IL-17单抗阻断IL-17后在单纯疱疹病毒性角膜基质炎（HSK）发病中的作用，观察对疾病严重程度的影响。,五、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案,动物分组 雌性BALB/c90只(中国医科大学动物实验室提供)，鼠龄46周,体重为1822 g，经检查双眼均无疾病。随机分组如下：,空白对照组（30只）,未做任何处理,生理盐水组（30只）,接种HSV-1病毒生理盐水腹腔注射,抗IL-17单抗组（30只）,接种HSV-1病毒抗IL-17单抗腹腔注射,五、拟采
7、取的研究方法、技术路线、实验方案,动物模型的制备（病毒接种）麻醉后置于显微镜下,用1 号无菌针头交叉划伤鼠右眼角膜上皮层呈“#”字形，将5 l 含有1 106空斑单位(plagueforming unit，PFU)/ml的HSV-1的链霉素改进的最小基础培养基（DMEM）液滴于角膜表面，同时轻轻按摩鼠睑。抗IL-17单抗注射 抗IL-17单抗组分别于鼠角膜接种HSV-1 的当天、接种后2 d及4 d 时,于鼠腹膜内注射抗IL-17单抗100l。生理盐水组注射等量生理盐水。,五、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案,空白对照组,生理盐水组,抗IL-17单抗组,临床观察,HE染色,免疫组织化学染色
8、,取材,在接种后3d、7d、10d、14d、21d，从各组随机抽取5只小鼠脱颈处死，迅速摘除眼球固定,发病率、死亡率、疾病程度、角膜新生血管,对免疫组化染色结果进行图文分析半定量测量IL-17、IFN-、IL-6的表达。,五、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案,评估角膜基质炎的标准(0 4分)。0分：角膜基质清晰透明；1分：角膜基质稍混浊；2分：角膜基质中度混浊，可透见后部虹膜特征；3分：角膜基质重度混浊，但仍可判断瞳孔缘的位置；4分：角膜基质完全混浊，失去后部特征。每天记录评分。并分别在术后3d、7d、10d、14d、21d，用裂隙灯数字图像处理系统照相。评估角膜新生血管化的标准：(02分
9、):0分,无新生血管长入角膜;1分,新生血管向心性生长,但未达到瞳孔中央或未超过角膜半径;2分,新生血管达到瞳孔中央或超过角膜半径。,五、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案,统计学分析 所有计数资料以疾病程度均数士标准差(XSD)表示，两组间差异显著性检验用SPSS13.0数据包进行t检验，以=0.05为标准，P0.05表示差异有统计学意义。对发病率及死亡率进行X2检验，以=0.05为标准，P0.05表示差异有统计学意义。,六、可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验方案、科研条件和经费）,1、Th17分泌的细胞因子IL-17生物学功能清楚。CD4+T细胞介导是HSK的主要发病机制。2、盛京
10、医院动物实验室具有繁殖饲养BALB/c小鼠的一切条件；实验室设备齐全满足免疫组化实验方法的需要，实验所需试剂均可购买到。,七、立题新意或立题创新之处,IL-17 在 单纯疱疹病毒性角膜基质（HSK）中所起的作用及其机制的研究未见报道。,八、研究计划（工作步骤、时间安排）,2009年02月2009年08月 撰写综述、开题报告。2009年09月2009年12月 构建模型、做预实验。2010年01月2011年01月 实验经验、撰写论文。,九、实验地点及所需主要仪器、药品、试剂和动物等,（一）实验地点 中国医科大学附属盛京医院中心实验室(二）实验仪器 恒温水浴箱、组织显微镜、眼科手术器材、石蜡切片机、
11、光学显微镜、生物组织自动脱水机、石蜡包埋机、4冰箱、HAAG-STREIT BERN BD900裂隙灯显微照相系统,九、实验地点及所需主要仪器、药品、试剂和动物等,（三）药品、试剂 病毒为隔离的人的高神经毒力的HSV-1 Mckrae 毒株(美国华盛顿大学眼科中心提供)。SP试剂盒、IL-17Ab、PBS、DAB、抗IL-17抗体、淋巴细胞提取液（购自北京中衫金桥生物技术公司。苏木素、乙醇、丙酮、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、氯仿（购自上海第六试剂厂）。（四）实验动物 BALB/c 小鼠，体重18-22g,十、预期研究成果,1、IL-17在HSK小鼠中的表达升高。2、注射抗IL-17单抗后小鼠的HSK炎症反应减轻。,
