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1、一、革兰氏染色法原理,1.细菌的细胞壁组成和结构差异,G+：壁厚，肽聚糖含量高，类脂质含量低G-：壁薄，肽聚糖含量低，类脂质含量高,革兰氏阳性细菌细胞壁 革兰氏阴性细菌细胞壁,初染 媒染 复染 脱色,2.染色,（结晶紫）,（碘液）,（乙醇）,（番红）,G+：蓝紫色G-：红色,革兰氏染色,甲菌,乙菌,复染,沙黄,紫色（G）,红色（G-）,1、制片（1）涂菌：用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1 cm的菌膜。（2）干燥：自然干燥或火焰上部略加温加速干燥。（3）固定：将细菌涂片面向上，通过火焰3次。,二、操作步骤,G+:Staphylococcus
2、aureusG-:Escherichia coli,实验策略,用铅笔做好标记,2、染色(p82-83),滴加结晶紫染液初染1 min水洗,滴加卢戈氏碘液媒染1 min 水洗,滴加95乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(约30 s)水洗,滴加番红复染12 min 水洗,用滤纸吸干，待镜检。,初染,媒染,脱色,复染,冲残水,吸残水,3、显微镜观察（油镜）。,1.菌龄：应选择活跃生长期的培养物作革兰氏染色。培养时间过长，或死亡及部分自溶，改变了细菌细胞壁的通透性，造成阳性菌的假阴性反应。2.涂片不宜过厚，以免脱色不完全，造成假阳性。3.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌
3、也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。,三、革兰氏染色注意问题及对策,G+,G-,用KOH区分革兰氏染色阴性和阳性细菌*,实验原理：,G-：壁薄，肽聚糖含量低，类脂质含量高。脂多糖和蛋白质的复合物遇强碱形成粘稠的胶胨状物，可以拉出粘状丝来。G+：壁厚，肽聚糖含量高，类脂质含量低。细胞壁坚固，对强碱无此反应，不能拉出粘状丝来。,实验方法：,载玻片上滴一小滴3%KOH溶液,用接种环接挑取被检细菌于3%KOH溶液中混匀,30-60 s后观察菌液是否变粘稠，并拉出丝来,根据实验结果鉴别G+和G-,结果:1、p84 1.（1）、（2）：描述(绘)所观察细菌(G+和G-)的个体形态；2、描述KOH试验的结果；思考题 1、p84 2.（3）题 2、KOH试验现象直观，可否取代现有染色方法，为什么？,四、实验报告,操作考核,端正坐姿，臂悬空托住瓶底，慢拔塞皿底在上，翻过来悬空倒下，轻晃动平推平板，勿再碰冷却凝固，倒放置写上标记，在皿底,下次实验,实验六.细菌的鞭毛染色与运动性观察,
