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1、一、正确留取标本是获得准确结果的前提,1.血液、骨髓、无菌体液：（1）严格消毒、避免体表正常菌群的污染。（2）应在抗生素使用之前抽血。如果病人已使用抗生素，应选择含中和剂（活性炭、中性树脂）的培养瓶，或在下次用药前采血。（3）由于血液、骨髓、无菌体液含有极少量的病原体，就可以造成感染性疾病，而实验室检出率与病原体数量有关，并非只要有病原体就能检验出来，因此血液、骨髓、无菌体液等必须增菌才能获得满意结果。成人未使用抗生素治疗采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水、关节液3-10毫升接种成人培养瓶（蓝盖）；成人已使用抗生素治疗采集上述标本接种加中性树脂培养瓶（灰盖）；儿童采集骨髓0.5-1毫升，血液
2、、胸腹水，关节液1-3毫升接种儿童培养瓶（红盖）；厌氧培养接种上述标本3-10毫升于厌氧培养瓶（黄盖）。（4）由于菌血症、败血症是间歇排菌，应在发热高峰时采血，对于感染性心内膜炎患者增加采血次数，以提高阳性率。,2.导管相关性的血流感染（CRBSI）血培养（1）第一采集方法经外周静脉穿刺采血1套（送两个培养瓶）；从导管中心或静脉留置口隔膜采血1套，两者的采血时间应该接近（5分钟）。,结果解释：（a）依据细菌鉴定和药敏试验确认，若两套阳性血培养是同一种细菌，又没有其它部位的感染，提示CRBSI；（b）若两套阳性血培养瓶是同一种细菌，从导管采血血培养报告阳性时间比外周静脉穿刺采血早120分钟，又没
3、有其它部位的感染，提示CRBSI；,（c)依据细菌鉴定和药敏试验确认，若两套阳性血培养是同一种细菌，又没有其它部位的感染，从导管采血血培养报告阳性时间比外周静脉穿刺采血不足120分钟，提示CRBSI；（d）若外周静脉穿刺采血血培养是阴性，只有导管采血的血培养是阳性，不能定为CRBSI；,（e）若只有外周静脉穿刺采血的血培养是阳性，但分离菌为金黄色葡萄球菌或念珠菌，且没有任何其它部位感染的证据，提示高度可疑为CRBSI；（f）若再次导管采血/外周采血，若培养阳性，且是同一种细菌，可定为CRBSI；,（2）第二种采集方法：外周静脉穿刺采血采集12套，同时拔出导管，用Maki导管平皿滚动法，对导管尖
4、片段进行半定量培养。,结果解释：（a）如果两套外周静脉穿刺采血培养是阳性，导管片段培养为阳性（15CFU/平皿），提示为CRBSI；（b）如果两套外周静脉穿刺采血培养是阴性，导管片段培养为阳性，提示可能为导管上的定植菌，不支持CRBSI；,（c）若所有的血培养和导管片段培养是阴性，不太可能是CRBSI；（d）如果有1套的血培养是阳性，导管片段的培养是阴性，但分离株是金黄色葡萄球菌或念珠菌，且没有任何其它部位的感染证据，提示仍有可能是CRBSI。,3.尿液：（1）导尿法：是一种较好的无菌采集法，主要适用于手术后患者，取10-15毫升尿液于无菌容器内送检，但留置导尿管易造成医院内感染。（2）中段尿
5、采集法：是临床上最多采用的方法，女性病人先以肥皂水或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗外阴及阴道口；男性病人应翻转包皮冲洗，用1：1000新洁尔灭消毒尿道口，在用无菌纱布擦干，让病人排尿，弃去前段尿，收集中段尿1020ml，盛于无菌容器内，立即加盖送检。,（3）肾盂尿采集法：为确定菌尿是否来自肾脏，可用导尿管采集肾盂尿。首先充分冲洗膀胱，以最后一次冲洗尿作对照，后用导尿管插入输尿管，分别标记左右侧，收集3次尿；如果输尿管菌数比对照尿菌数多或第3次尿中菌数比第1次多，该菌尿可能来自肾脏。反之，如果第1次尿菌数多于第3次尿菌数，则可能来自膀胱。肾盂尿采集法一般应该请泌尿科医师协助进行，并确实做好标记，
6、以防左右侧搞错。,（4）膀胱穿刺尿采集法：将病人耻骨上皮肤碘酒、酒精消毒后，以无菌针筒作膀胱穿刺。此法主要用于尿液中厌氧菌的培养，故在取得尿液后，针头插于橡皮塞上送检。当儿童或婴儿采集中段尿困难或培养结果与患者病情有矛盾时，可考虑用此法采集尿液。（5）留尿法：尿液检查结核分枝杆菌时，可用一洁净容器，留取24h的尿液，取其沉淀部分200-250毫升盛于清洁瓶内送检。实验室人员接受后应全部离心，涂片镜检。,4.痰液：正常人下呼吸道是无菌的，上呼吸道有正常菌群寄居。下呼吸道的分泌物必须通过上呼吸道，常受上呼吸道的正常菌群的污染。因此对于下呼吸道分泌物培养出来的结果必须分析、判断。一般要求病人清晨用无
7、菌生理盐水漱口6次，再用冷开水漱口一次，用力咳深部的痰液于无菌容器内送检，避免口水的污染。对于痰液不能自主咳出，可采用高渗盐水雾化吸入排痰。,实验室在收到痰标本，涂片革兰染色（SEC25/LPF）可做细菌培养，记录涂片结果，SEC25/LPF，WBC10/LPF，视为污染，建议重留标本；介于二者之间做细菌培养，记录涂片结果，结合培养后细菌数量考虑是否是致病菌。合格的痰标本用无菌生理盐水约20毫升漂洗2次，用等量的sputosol作用20分钟。用接种环四区划线，从一区到另一区应灭菌，接种直径9厘米的血平板两块，巧克力平板一块，沙包氏培养基。,置CO2环境下培养。从采集标本到接种应在2小时内完成。
8、未发现致病菌，再培养72小时。若怀疑结核感染找抗酸杆菌，应收集24小时的痰液于清洁玻璃容器内。若怀疑放线菌感染，应让病人留取含有颗粒的痰液，实验室查到硫磺颗粒且弱抗酸，可以考虑放线菌 感染。若怀疑口腔正常菌群紊乱或口腔霉菌感染，可以用无菌棉签取咽峡部分泌物于无菌容器内送检。,5.皮肤、创面：首先按常规消毒皮肤，然后用无菌注射器抽吸皮下病变部分，或用无菌棉签取痂下脓性分泌物。6.生殖道分泌物：根据病人主述临床症状，采用不同方式取材：若病人白带呈淡黄色，稀水样，考虑滴虫感染，用无菌棉签取阴道分泌物于1毫升生理盐水内送检，注意保温，因为目前滴虫的检验主要看鞭毛摆动的动力。若病人白带呈“豆腐渣”样，烧
9、痒症状，用无菌棉签取“豆腐渣”样白带送检，选择不同的送检方式和检验方法可获得不同的检验结果，其方法有生理盐水直接镜检、涂片加NaOH破坏上皮细胞镜检、革兰染色镜检，一般认为革兰染色镜检是较为理想的方法。,对于口腔、阴道等部位由于采用染色方法提高酵母菌检验灵敏度，对于是定植还是致病，目前缺少诊断依据。若怀疑淋病患者，对于男性急性患者，用一支棉签檫去尿道口脓液，轻轻挤压尿道口，再用一支棉签取其脓液；对于男性慢性患者或治疗后复查的患者，用一支棉签伸入尿道口2-4厘米，停留数秒钟，旋转取出，因为尿道口寄居的是鳞状上皮细胞，尿道 2-4厘米寄居的是柱状上皮细胞，这是淋球菌寄居的地方。对于女性患者，用温水
10、湿润的扩阴器，取阴道分泌物或宫颈分泌物，棉签停留数秒钟，让棉签充分吸附分泌物。从直肠取材时，应将棉签插入肛门2.5厘米以上，碰到粪便，应换一个棉签重取。检查淋球菌性咽炎时，应从扁桃体及扁桃体窝取材。,支原体检查：支原体是简单的原核细胞，没有细胞壁，缺乏许多细胞器，直接镜检没有意义，只有通过培养，取材显得重要，采集标本时，男性患者可用尿道拭子或清晨中段尿培养，女性推荐阴道拭子。衣原体检查：采取尿道标本，至少在排尿1小时后采集，对于男性尿道取材，棉拭子应伸入尿道2-4厘米（因为衣原体寄生在粘膜柱状上皮细胞，而不是寄生在复层鳞状上皮细胞中），转动拭子以获得细胞；对于女性尿道取材，先用一个拭子擦净尿道
11、口，再用棉拭子,（小）伸入尿道2厘米，轻轻转动拭子取出，对于女性宫颈取材，用温水湿润的扩阴器扩张阴道，先用一个拭子擦净宫颈口，然后再用棉拭子（小）伸入宫颈内1-2厘米，用力摩擦采取宫颈细胞，不采用脓液作培养。直肠取材，可将拭子插入肛门括约肌，在肛门和直肠结合处沿肠壁转动，持续10-30秒，以吸取微生物，并避免粪便的污染。尿液、精液、服过抗生素的病人标本以及新近用过某些阴道制剂、清洁剂等病人标本不宜作衣原体检查。,二、正确检验病原体,1.及时接种，选择合适培养基：由于体外环境不是微生物生长的最适宜环境，微生物怕冷、热、光、干燥、消毒剂，因此实验室接受标本后，应立即接种；不同微生物需要不同的营养要
12、求和环境，选用不同的培养基，制备不同的环境，例如解脲支原体需要解脲支原体培养基，脑膜炎奈瑟氏菌需要营养丰富的巧克力血平板和5-10%CO2，淋球菌需要Thayer-Martin（T-M）、NYC培养基和5-10%CO2。除此之外，为了更好分离致病菌、抑制正常菌群和污染菌，需要加入一些营养因子和抑菌剂。例如淋球菌T-M培养加入血红蛋白、万古霉素、多粘菌素、制霉菌素、磺胺嘧啶。万古霉素抑制葡萄球菌的生长，多粘菌素抑制铜绿假单胞菌的生长，制霉菌素抑制念珠菌的生长，磺胺嘧啶抑制变形杆菌的生长。有利的一面，利于淋球菌的的识别；不利的一面是遗漏可能的致病菌，患者易产生继发感染：继发霉菌性阴道炎、淋病治愈后
13、葡萄球菌性尿道炎。,2.如何将含量少的病原体检验出来？及时接种，避免微生物的死亡。某些感染必须增菌，以获得足够数量的病原体，血液、骨髓、胸水、腹水、脑脊液、关节液等必须接种到增菌培养基上。选用营养丰富的培养基、提供适宜的环境，满足不同病原体的要求。采用灵敏的方法检测病原体。,3.如何从众多的正常菌群中辨别致病菌？采用 营养丰富的培养基和适宜的环境满足致病菌的生长。采用含抑制剂的培养基筛选致病菌。如解脲支原体培养基除含小牛血清外，还含有青霉素；分离大肠埃希氏菌O157，H7所用培养基是山梨醇麦康凯培养基。运用丰富、扎实的知识识别致病菌。对于痰液：致病菌是脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、奴
14、卡菌；可能致病菌是念珠菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌（指除凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌之外的所有凝固酶阴性葡萄球菌统称，目前包括31个种，是一种习惯称法）、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、卡他粘膜炎奈瑟菌等。,一般不是致病菌是指草绿色链球菌。对于尿液：分离到两种以下的细菌，可能是病人寄居的细菌，若分离到三种或三种以上，可能是污染菌，建议病人重新留取标本。在报告细菌的同时，应报告菌落计数，过去认为对于革兰阴性杆菌105 CFU/ml有致病意义，革兰阳性球菌104 CFU/ml有致病意义；现在认为只要病人有主述症状，菌落计数100 CFU/ml就有致病意义。,4.正确认识菌体形态和菌落形态通过革
15、兰染色将细菌分为：革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌。由于该法简单、迅速，广泛用于微生物检验。在无菌部位出现相应细菌，帮助我们用药，在有菌部位，帮助我们分析是否菌群紊乱。通过抗酸染色将细菌分为：抗酸杆菌和非抗酸杆菌，对于通过痰液排菌的肺结核患者、皮肤麻风患者、结核性脑膜炎患者有较大的帮助。,通过墨汁染色可以直接判断有无新型隐球菌感染。菌落特征有突起、凹陷、色泽、色素等表面特征：肺炎链球菌呈现肚脐样凹陷，沙雷氏菌出现红色色素，铜绿假单胞菌有绿色、无色色素，有姜味气味，可呈现粘液型菌落、粗糙型菌落、光滑型菌落。,5.正确鉴别病原菌 对于细菌而言，主要依据表型特征，菌体、菌落形态
16、，溶血性、生化反应，血清凝集将细菌鉴定。革兰阳性球菌中葡萄球菌主要依据凝固酶、新生霉素抑菌试验、生化反应来判断；肠球菌依据6.5%NaCL、胆汁七叶苷与葡萄球菌、链球菌鉴别，依据甘露醇、山梨醇、山梨糖、精氨酸、阿拉伯糖、棉子糖、动 力、黄色素、蔗糖、丙酮酸盐来鉴别属内12个种；链球菌属依据cAMP、DNA、杆菌肽、血清凝集来鉴别。,革兰阴性球菌主要依据氧化酶、DNA酶、生化反应来鉴别，淋球菌氧化酶阳性、DNA酶阴性、葡萄糖阳性、乳糖阴性、麦芽糖阴性、甘露糖阴性、蔗糖阴性；脑膜炎奈瑟氏菌氧化酶阳性、DNA酶阴性、葡萄糖阳性、乳糖阴性、麦芽糖阳性、甘露糖阴性、蔗糖阴性。革兰阳性杆菌主要依据菌体、菌
17、落，特征性染色来鉴别，结核分枝杆菌抗酸染色阳性，白喉棒状杆菌Albert染色出现异染颗粒，产单核李斯特菌溶血性和动力。革兰阴性杆菌主要依据氧化酶、氧化-发酵（O-F）试验来判断。,氧化酶阴性、氧化-发酵（O-F）发酵 肠杆菌科编码 补充生化反应鉴定到种。对于致病性大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌还需血清学凝集。,氧化酶阴性、氧化-发酵（O-F）氧化 非发酵菌编码氧化酶阳性、氧化-发酵（O-F）氧化/-补充生化反应鉴定到种。氧化酶阳性、氧化-发酵（O-F）发酵 弧菌科编码 补充生化反应、血清学凝集鉴定到种，如霍乱弧菌O1、O139等。对于真菌而言，主要依据菌体形态、菌落形态、色素，同化试验、发酵试验来
18、鉴别至种属。实验室人员困惑：由于上述细菌、真菌鉴定依靠表型特征，表型是受基因控制，同一基因型可能有不同种表型，同一表现型可能受不同基因型所控制。根据表现型判断的菌体能代表真正的菌属吗？随着分子生物学的发展，人们能任意改造表现型。我们能有所作为吗？,三、恰如其分报告药敏结果,药敏试验中药敏纸片选用：临床医生经常反映，实验室所报告的药敏试验结果，临床根本或很少使用这类药物，实验室药敏试验中药物是敏感，临床使用无效。如何联合用药、合理用药？实验室人员应根据可能的细菌种类、细菌的菌属，合理选用药敏纸片，报告检验结果。实验室应根据美国FDA推荐临床微生物实验室苛养菌和非苛养菌分组的药物选用，它将药物分为
19、四组：A组，一级试验并常规报告的抗生素；B组，一级有选择报告的抗生素；C组，补充试验，有选择报告的抗生素；U组，用于泌尿道补充试验的药物。,例如对于肠杆菌科细菌常规报告的抗生素有氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻吩、庆大霉素；选择报告的抗生素有阿米卡星、阿莫西林/棒酸或氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、头孢孟多或头孢尼西或头孢呋辛、头孢吡肟、头孢美唑、头孢哌酮、头孢替坦、头孢西丁、头孢噻肟或头孢唑肟或头孢曲松、环丙沙星或左氧氟沙星、亚胺培南或美罗培南、美洛西林或哌拉西林、替卡西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。,对于铜绿假单胞菌和不动杆菌常规报告的抗生素有头孢他啶、庆大霉素、美洛西林或替卡
20、西林、哌拉西林，选择报告的抗生素有阿米卡星、氨曲南、头孢哌酮、头孢吡肟、环丙沙星、亚胺培南或美罗培南、妥布霉素。对于葡萄球菌常规报告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，选择报告的抗生素有阿奇霉素或克拉霉素或红霉素、克林霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、万古霉素。,对于肠球菌常规报告的抗生素有青霉素/氨苄西林，选择报告的抗生素有万古霉素。对于嗜血杆菌常规报告的抗生素有氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，选择报告的抗生素有头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟或头孢曲松、头孢呋辛钠（针剂）、氯霉素、美罗培南。,对于肺炎链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉素（苯唑青霉素）、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，选择报告的抗生素有格帕沙星、左
21、氧氟沙星或司氟沙星、氧氟沙星、四环素、万古霉素。对于除肺炎链球菌以外其它链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉素、氨苄西林，选择报告的抗生素有氯霉素、克林霉素、万古霉素、头孢吡肟或头孢他啶或头孢曲松、左氧氟沙星、氧氟沙星、Linezolid、奎奴普汀/达福普汀。,对于淋球菌常规报告-内酰胺酶结果，如-内酰胺酶阳性提示青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药，但淋球菌更多的是染色体介导的耐药，需要做补充药敏试验，选择报告的抗生素有头孢克肟或头孢噻肟或头孢泊肟或头孢唑肟或头孢曲松、头孢美唑、头孢替坦、头孢西丁、头孢呋辛、环丙沙星、格帕沙星或氧氟沙星、青霉素、大观霉素、四环素。,遵循严格的操作方法、施加质量控制
22、：纸片扩散法（K-B）法、液体稀释法必须遵循NCCLS（CLSI）规定，它对纸片厚度、药物浓度、培养基、培养环境、孵育温度、操作方法都有详细规定。E-test必须按照其说明要求进行。运用丰富的理论知识，提示临床用药：对于肠道分离的沙门菌和志贺菌属，常规仅测试氨苄西林、一种喹诺酮类药物和TMP/SMZ药物，1、2代头孢菌素尽管体外敏感，但临床治疗无效，实验室不能做此药敏试验。对于肠道外分离株，沙门氏菌属还一定要测试并报告氯霉素和某一种三代头孢菌素。,对于MRSA、MRSCON、ESBLs、高耐庆大霉素肠球菌、AmpC-内酰胺酶应有所选择性报告药敏结果，有时体外药敏结果是敏感的也要报告耐药。,1.
23、药敏试验种类和方法：（1）细菌药敏试验纸片扩散法液体稀释法E-test法,（2）酵母样真菌药敏试验纸片扩散法液体稀释法E-test法浅部真菌目前尚没有标准方法。,细菌药敏试验-纸片扩散法,Kirby-Bauer agar disk diffusionPaper disk containing antibiotic is placed on lawn of bacteria,then incubated overnight.Diameter of zone of inhibition is inversely related to MIC(used to establish interpreti
24、ve breakpoints).Standardized for commonly isolated,rapidly growing organisms.,细菌药敏试验-液体稀释法,Minimal inhibitory concentration(MIC)Reference method.Add standard inoculum to dilutions of antibiotic.Incubate overnight.MIC is lowest concentration that inhibits growth(can also be performed by agar dilution
25、).Interpretation(S or R)is based on achievable drug levels,细菌药敏试验-E-test法,E-testStrips containing a gradient of antibiotic are placed on lawn of bacteria and incubated overnight.MIC is determined at point where zone of inhibition intersects scale on strip.Combines ease of KB with an MIC method.Parti
26、cularly useful for S.pneumoniae.,医院内感染菌常常是一些耐药菌，实验室应对这些细菌的耐药表型进行检测。肠杆菌科（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、变形杆菌）应作超广谱内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）、耐糖肽类抗生素的肠球菌（VRE）。,四、耐药表型的检测,1、甲氧西林葡萄球菌的检测：MRSA(Methicillin-resistant Staphylococus aureus)、MRSCON（Methicillin-resistant coagulatase-negative Staphylococcal species）检验：,（1
27、）纸片扩散（K-B）法由于苯唑青霉素较甲氧西林青霉素稳定，不易失活，通常使用苯唑青霉素代替甲氧西林青霉素测定葡萄球菌。M-H琼脂平板，直接菌落悬液法，苯唑青霉素纸片含量为1 g/片，3524小时孵育，抑菌圈直径10mm。2004年NCCLS推荐耐甲氧西林葡萄球菌评判标准:采用头孢西丁纸片（30 g）,孵育24小时,对于金黄色葡萄球菌抑菌圈21mm为MRSA，22mm为MSSA;对于凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈24mm为MRSCON，25mm为MSSCON.,(2).琼脂稀释法筛选试验：苯唑青霉素耐药培养基：含NaCL的M-H琼脂（4%W/V；0.68mol/l）抗生素含量：6g/ml苯唑青霉素或1
28、0 g/ml甲氧西林接种：直接菌落悬液约0.5麦氏比浊管，用拭子浸润菌悬液后，在平板表面点种或划线。培养条件：35空气培养时间：24小时，对于甲氧西林/苯唑青霉素耐药的凝固酶阴性葡萄球菌，孵育48小时后再检测最可靠。结果：1菌落=耐药推荐质控菌：金黄色葡萄球菌ATCC29213敏感，金黄色葡萄球菌ATCC43300-耐药,目前治疗方案：MRS轻度感染：利福平、SMZ-TMP、环丙沙星；严重感染：万古霉素。对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌称之为VRSA（Vancomycin-risistant S.aureus）只能用链阳霉素治疗。目前金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药尚不多见，国外学者将肠球菌耐万古霉
29、素基因转移到金黄色葡萄球菌中已获得成功；日本、香港散在报道且仅万古霉素低度耐药（MIC8 g/ml），且国际上尚未承认；2002年6月美国从一40岁患有糖尿病、慢性肾脏衰竭患者导管中分离到对苯唑青霉素MIC 16 g/ml,对万古霉素MIC128 g/ml的耐万古霉素的金黄色葡萄球菌，VRSA就在我们眼前。,2.肠球菌的检测：肠球菌是一种重要的病原微生物，实验室应做高耐庆大霉素肠球菌的检测。若高耐庆大霉素，则不能和作用细胞壁的药物（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）协同使用。有条件的实验室还应作Van A,Van B,Van C耐药基因监测。治疗原则：Van A：青霉素敏感（S），氨基糖苷类非高耐
30、-青霉素+庆大霉素；青霉素耐药（R），氨基糖苷类非高耐-青霉素/头孢类+壁霉素+庆大霉素。Van B：氨基糖苷类非高耐株-壁霉素+庆大霉素。氨基糖苷类高耐株-壁霉素，新生霉素+氟喹诺酮类。多重耐药的肠球菌目前尚无有效的治疗方案。,（2）肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药筛选试验（琼脂稀释法）筛选试验 庆大霉素HLAR抗生素含量：500g/ml接种：液体生长法或直接菌落法至 0.5麦氏比浊管。琼脂-10ul0.5麦氏比浊管悬液点种在琼脂表面。孵育条件 35空气孵育时间 24小时结果：琼脂：1菌落=耐药；肉汤：任何生长=耐药,耐药-不能和作用细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素），
31、敏感-可以和敏感的作用于细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药,筛选试验：万古霉素耐药抗生素含量：6 g/ml接种：肉汤-推荐标准肉汤稀释法。液体生长法或直接菌落法至 0.5麦氏比浊管。1-10 l0.5麦氏 比浊管悬液点种在琼脂表面。孵育条件：35空气孵育时间：24小时结果：1菌落=耐药 进行万古霉 素MIC测定 和动力试验产生的色素来区别获得性耐药（VanA,VanB）和那些对万古霉素天然的中 水平耐药（VanC）如敦鸡肠球菌、铅 肠球菌和黄肠球菌，它们通常在万古霉素 筛选平板上生长。质控菌株：粪肠球菌
32、ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药,3.超广谱 内酰胺酶检测：超广谱-内酰胺酶（ESBLs）是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯氏菌等革兰氏阴性杆菌在抗生素选择压力下产生。它是质粒介导的对第一、二、三头孢菌素、氧亚氨基-内酰胺抗生素耐药，有时尽管体外试验是敏感的，是-内酰胺酶基因Tem-1,Tem-2,SHV-1突变而来。ESBLs编码基因在质粒上，易在不同菌株间播散，表现为多重耐药。目前将ESBLs分为TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型。共同特点是能被-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。,(1)纸片初筛：培养基：Muller-Hinton琼脂
33、药敏纸片浓度:头孢泼肟 10 g 或头孢他啶30 g 或头孢噻肟 30 g 或头孢曲松 30 g（使用两个以上纸片做筛选试验可提高检出灵敏度）接种：按标准纸片扩散法孵育条件：35大气环境孵育时间：16-18小时结果：头孢泊肟抑菌环 22mm，头孢他啶抑菌环22mm，氨曲南抑菌环 27mm，头孢噻肟抑菌环27mm，头孢曲松抑菌环 25mm，=可能产生ESBL。建议质控方法:大肠埃希菌ATCC25922（参考NCCLS抑菌标准）肺炎克雷伯菌 ATCC700603:头孢泼肟抑菌环 9-16mm,头孢他啶抑菌环 10-18mm,氨曲南抑菌环 9-17mm,头孢噻肟抑菌环 17-25mm,头孢 曲松抑菌
34、环 16-24mm。,(2)纸片确证试验：培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度：头孢噻肟 30 g、头孢噻肟/棒酸 30 g/10 g和头孢他啶/棒酸 30 g/10 g接种：按标准纸片扩散法孵育条件：35大气环境孵育时间：16-18小时 结果：混合棒酸药物纸片的抑菌圈直径比无棒酸药物纸片的直径大5 mm 以上=ESBL建议质控方法：大肠埃希菌ATCC25922单独药物和混合棒酸药物两种纸片的抑菌环直径相差不大于2mm。肺炎克雷伯菌 ATCC700603：头孢他啶单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢他啶单独药物纸片抑菌环直径增大5 mm以上，头孢噻肟单独药物和混合棒酸药物纸片抑
35、菌环较头孢噻肟单独药物纸片抑菌环直径 增大3 mm以上。,(3)液体稀释法初筛:培养基：CAMHB（调节好阳离子的M-H肉汤）抗生素浓度：头孢泼肟 4g/ml 或 头孢他啶1 g/ml 或氨曲南 1 g/ml 或头孢噻肟 1 g/ml 或头孢曲松1 g/ml（使用1种以上药物做筛选试验可提高检出灵敏度）接种：按标准肉汤稀释法的规定进行孵育条件：35；空气孵育时间：16-18小时结果判读：生长=可疑有ESBLS的产生（即头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松 MIC2 g/ml；头孢泼肟MIC8 g/ml）质控建议：大肠埃希氏菌ATCC25922不长肺炎克雷伯氏菌ATCC700603，头孢泼肟MI
36、C8 g/ml,(4)液体稀释法确证:培养基:CAMHB药物浓度:头孢他啶0.25-128g/ml,头孢他啶/克拉维酸0.25/4-128/4g/ml和头孢噻肟0.25-64g/ml,头孢噻肟/克拉维酸0.25/4-64/4g/ml。确证试验需要同时使用头孢他啶、头孢噻肟，单独和联合克拉维酸复合制剂。接种:按标准肉汤稀释法的规定进行孵育条件:35空气孵育时间:16-20小时结果判读:对2个中任何一个药物的MIC，在加入克拉维酸后，MIC与不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度，判定为ESBLs（如头孢他啶的MIC=8 g/ml，头孢他啶/克拉维酸的MIC为1 g/ml）。质控建议:肺炎克
37、雷伯菌ATCC700603：联合克拉维酸的复合制剂的MIC与单药的MIC相比，应当降低3个以上对倍稀释度。,治疗原则是：1.碳青霉烯类抗生素，2.-内酰胺类/酶抑制剂,3.氨基糖苷类抗生素如阿米卡星，4.头霉烯抗生素如头孢西丁。在超广谱-内酰胺酶 检测条件不具备的地方，临床可以通过实验室报告的作推测治疗，若药敏报告提示三代头孢例如头孢泼肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松有二者以上耐药极有可能是产超广谱-内酰胺酶。,4、D试验-克林霉素诱导耐药试验：葡萄球菌对大环内酯类抗生素耐药表现为：由msrA基因介导的主动外排机制，即M型耐药；抗生素作用靶位的改变，即由erm基因编码的RNA甲基化酶对
38、细菌核糖体50S亚基23SrRNA进行特定核苷酸残基甲基化，使药物与靶位的结合能力下降，导致对具有相同靶位的大环内酯类、林可酰胺类、链阳菌素B三类药物同时耐药，临床称为MLS型耐药。体外药敏试验又可将MLS型分为结构型（cMLS型）和诱导型（iMLS型）；cMLS型为红霉素和克林霉素均耐药；iMLS型红霉素耐药、克林霉素敏感。,对大环内酯耐药的葡萄球菌可能对克林霉素的耐药,通过erm 基因编码的23S rRNA 甲基化也称为MLSB（大环内酯、林可和B 型链阳霉素）耐药，或只对大环内酯类耐药（由msrA 基因编码的外排机制）。,M-H平板或血平板，纸片相邻试验，对于葡萄球菌，距红霉素纸片（15g/片）边缘1526mm 处放置克林霉素纸片(2g/片)来进行检测；对于-溶血链球菌，将克林霉素纸片(2g/片)和红霉素纸片（15g/片）贴在相邻的位置，纸片边缘相距12mm。,35空气，16-24h孵育后，克林霉素抑菌环不出现“截平”现象，应报告分离株对其敏感。邻近红霉素纸片侧克林霉素抑菌环出现“截平”现象（称为“D”抑菌环），提示存在可诱导的克林霉素耐药，应报告分离株对其耐药，在报告中应注明“通过诱导克林霉素耐药试验，推测此菌株对克林霉素耐药，克林霉素对某些病人可能仍有效”；若无“截平”现象，则应报告菌株对克林霉素敏感。,谢谢！,
