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1、遗传的中心法则,转录 翻译复制 DNA mRNA Protein 逆转录（半保留不连续复制）,第五章 病毒的遗传与变异,遗传和变异是生命的基本特征遗传：亲代与子代之间的形态结构与生理机能的相似性变异：亲代与子代之间、子代各个体之间的差异性,第五章 病毒的遗传与变异,一、病毒遗传变异的物质基础二、病毒的变异三、病毒变异的研究方法四、病毒的遗传学研究,第五章 病毒的遗传与变异,噬菌体标记试验 植物病毒重建试验甲病毒核酸 杂种病毒 感染细胞 子代病毒 乙病毒衣壳（完全甲病毒）病毒的遗传是相对的，变异是绝对的,一、病毒遗传变异的物质基础,T2噬菌体感染实验（1952年）,RNA作为遗传物质,生化提取分
2、别获得含RNA的烟草花叶病毒蛋白质外壳（病毒1）和核酸（病毒2）,抗血清处理，证明杂种病毒的蛋白质外壳来自病毒1，而非病毒2,杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现为病毒2，而非病毒1,遗传物质是核酸（RNA）而非蛋白质,二、病毒的变异,（一）病毒突变体株系：同一病毒的不同系或分离物“型”：同一病毒的不同血清型变种：与原始野生型株系不同的病毒突变体分离物,二、病毒的变异,病毒突变的类型：突变类型是一个多标准、多层次和不同水平的分类。从突变引起的遗传信息的意义改变来看，可分为：synonymous、missence和nonsense mutation从突变效应背离或返回到野生型这两种方向上讲，可分为：f
3、orward和reverse mutation从突变带来的表型改变来看，可分为：形态突变体、致死突变体、条件致死突变体和生化突变体等从引起突变的原因来看，可分为：spontaneous mutation，induced mutation,二、病毒的变异,病毒突变的类型：spontaneous mutation在没有任何已知诱变剂存在的条件下，一些病毒在子代中产生高比例的突变体在基因组为RNA的病毒中，自发突变率高得多(10-310-6)，原因是RNA复制酶中缺少校正阅读活性induced mutation利用自然界各种物理或化学诱变剂处理野生型病毒能够诱发突变，提高病毒群体中的突变率。体外诱变
4、剂：对病毒的静态核苷酸进行化学修饰，使其在后面的复制中碱基配对发生改变，导致同型碱基置换和异型碱基颠换，如亚硝酸、羟胺、烷化剂等体内诱变剂：作用于代谢活跃的核苷酸，为碱基类似物或插入剂,二、病毒的变异,（一）病毒突变体动物病毒几种突变体：蚀斑突变体plaque mutant寄主范围突变体 host range mutant抗药性突变体 drug resistance mutant抗原突变体 antibody resistance mutant回复突变体 revertant 无效突变体null mutant温度敏感突变体temperature-sensitive,无效突变体中病毒的一个基因完全失
5、活，一般来说，核苷酸任何形式的改变都能产生无效突变体表型。不管是大的插入、缺失、无意义读框移位突变必然产生null突变体表型。部分突变体保留完整的功能蛋白片段。作用：确定必需基因,ts突变体是一种条件致死突变体。由误义突变产生，即突变体某个基因的核苷酸序列发生变化，在高温条件下(非允许温度)，该基因编码的蛋白质不能形成或不能维持它的功能构型，在允许温度(低温)条件下，这一蛋白质能形成功能构型，允许突变体增殖。允许温度下产生的蛋白质或粒子可能不耐热，ts突变可辅助鉴定突变体蛋白，或显示某一蛋白质是结构蛋白。,二、病毒的变异,（一）突变病毒核酸中基因组（遗传信息）发生遗传变异，而不是由于外来的其它
6、病毒或生物体遗传物质的介入所引起的变异位点突变point mutation 温度敏感变种（temperature sensitive,ts)空斑大小变种、酶缺陷变种、热适应变种等（多效作用pleiotropism)缺失突变deletion mutation 基因组的一部分丢失 有可能失去独立繁殖能力，甚至致死性,突变的结果有时导致病毒不能生存，如ts变种：在较低温度下多肽结构稳定，功能正常，在较高温度时结构变化，易被细胞蛋白酶降解。应用：减毒疫苗,Pleiotropism:几个明显不相关的表型效应由单个基因所决定。,缺失突变deletion mutation,缺陷性干扰（病毒）颗粒（defec
7、tive interfering particle,DI particle)在某些条件下，如细胞培养中接种大剂量病毒并连续传代，易感细胞被感染后只产生少量有感染性的病毒粒子，而大量病毒粒子的基因组不完全，成为DI 颗粒。具有普遍性，几乎所有RNA病毒各科和大多数DNA病毒各科都有发现对同源的完全病毒有干扰作用，这种现象在理论和致病作用中都很重要。,DI颗粒产生的一些特征：1、接种量过大,m.o.i 高,DI颗粒增加，完全病毒减少2、DI颗粒的产生受宿主细胞种类控制3、基因组不完全，有片段缺失4、与完全病毒形态无差异，沉降系数相近5、必须在完全病毒存在时才能增殖6、干扰同源病毒完整粒子的生成机理
8、尚不清，核酸链短，复制快，竞争强7、与病毒的持续性感染密切相关，可减轻发病，减少死亡，更可能引起慢性带毒感染m.o.i(multiplicity of infection):每一敏感细胞所能吸附的相应病毒的数量,3、病毒突变的分子机制取代substitution 一个核苷酸被另一个核苷酸所取代增加-缺失addition-deletion 一/几个（或一对）核苷酸增加或缺失重排rearrangement 代表一个或几个基因的多核苷酸片段连接顺序与原来的不同 蛋白质结构变化,（二）病毒之间的遗传互作,重组是混合感染中病毒基因组之间的物理作用根据基因组的结构分为3种：（1）分子内重组 intramo
9、lecular recombination通过核酸断裂与重接：（单一分子基因组病毒）（2）重配reassortment多分体病毒在混合感染中，来源于不同亲本病毒的基因组片段可能重新组合：,1、遗传重组,（二）病毒之间的遗传互作,(1)分子内重组 intramolecular recombination(2)重配reassortment(3)拷贝选择重组(copy-choice recombination)发生在部分具有单一分子基因组RNA病毒中,仍属于分子内重组,但不涉及核酸分子的共价断裂,RNA聚合酶选择性地连接到静止模板链上进行RNA子代链的合成,1、遗传重组,基因重组的类型(按重组病毒的
10、种类分:),（1）杂 交（2）活性病毒间的基因重组（3）灭活病毒间的基因重组（4）活性病毒与灭活病毒间的基因重组（5）病毒与细胞间的基因重组,1、遗传重组,（二）病毒之间的遗传互作,交叉复活cross reactivation:一株活性病毒与另一株相关但具有不同遗传标记的灭活病毒复合感染细胞,由于重组产生具有灭活病毒某些遗传标记的活性病毒重组体,又称标记拯救marker rescue。,2、多数感染复活multiplicity reactivation,现象：以同一株灭活病毒大量感染敏感细胞时，有时会产生活的感染性病毒。原因：在灭活过程中，遭受破坏的病毒基因组部位不同，发生所谓的致死性变异，虽
11、然单独地说，这些病毒都已灭活，但在用它感染大量敏感细胞时，由于取长补短，恢复了原毒株灭活前的所有基因结构而发生复活。理论上，灭活病毒感染组培细胞、或灭活疫苗（用紫外线、羟胺、原黄素等不太强的灭活剂时）都存在这种可能。,（二）病毒之间的遗传互作,病毒基因产物之间的互作 两种病毒感染同一细胞时，除可发生基因重组外、基因产物（蛋白质）的作用也可使产生的后代呈现表型变异1、表型混合phenotypic mixing2、互补作用complementation3、加强作用enhancement4、干扰作用interference5、互不干扰,（三）病毒之间的非遗传互作,1、表型混合 phenotypic
12、mixing在某些具有共同特点（如衣壳类型或出芽方式）的2种病毒混合侵染中，子代的表型具有双方亲代的特征，而基因型无变化。转壳现象,3、病毒之间的非遗传互作,混合感染产生的子代病毒是一种病毒的基因组完全被另一种病毒的外壳蛋白包裹.暂时性,2、互补作用 complementation同种或异种的许多病毒颗粒在混合感染同一细胞时，也可能发生：一种病毒的增殖为另一种病毒增殖所必需。如腺病毒与腺联病毒的关系。可发生于同种病毒的不同株系之间；异种病毒之间；活病毒与灭活病毒之间。互补作用与基因重组不同，不涉及任何病毒核酸的交换，可能一个病毒提供给另一病毒不能产生的基因产物，使后者能在混合感染的细胞中增殖。
13、应用互补试验可发现病毒结构中的功能单位及其与表型的关系。,（三）病毒之间的非遗传互作,3、干扰现象 interference,动物病毒的干扰现象早在1930s、1940s就已发现，自Isaacs(1957)发现干扰素后，才引起病毒学家的注意；干扰现象发生于不同的病毒间、同种病毒的不同毒株间；甚至同种的灭活病毒与活病毒之间；干扰机理可能不是单一的。,可能机理：（1）细胞膜上的病毒受体被第1种病毒破坏，使第2种病毒不能吸附；（2）第1种病毒封锁了第2种病毒mRNA的转译；或第1种病毒的核酸复制酶使第2种病毒的基因组丧失功能；（3）DI颗粒（Defective Interfering particl
14、e)；（4）干扰素(interferon,INF),3、干扰现象 interference,4、加强作用enhancements,在某些混合感染中，一种病毒可以增强第二种病毒的增殖见于2种互不相关的病毒间；偶见于同种病毒的两个变异株之间机理：一种病毒激活一种酶，促进另一病毒对细胞的穿透？,5、互不干扰,两种不同的病毒侵入同一宿主细胞，可各自独立繁殖，各自产生特征性的感染。如犬肾细胞培养可同时被犬瘟热病毒与犬肝炎病毒感染。,缺陷病毒 defective virus,在自然界中存在一些天生的缺陷病毒，它们在任何条件下都不能独立繁殖，必须依靠另一种病毒提供某些必需物质。后者称辅助病毒helper v
15、irus，前者称卫星病毒satellite virus它们之间具有天然的协作关系如：腺联病毒腺病毒罗氏肉瘤病毒禽白血病病毒(提供囊膜糖蛋白）HDVHBVDI颗粒是缺失突变的不完全病毒颗粒,缺陷病毒 defective virus,三种具有生物活性的缺陷病毒基因组整合缺陷基因组(integrated defective genomes)整合缺陷基因组在宿主细胞中通过转导，活化，失活，染色体断裂，染色体重排等方式产生感染表型变化卫星病毒(satellite virus)卫星病毒需要与之无关的其他病毒基因产物才能复制，大多数具有独特的基因组序列依赖辅助因子的缺陷干扰病毒(helper-depende
16、nt defective interfering virus)DI病毒具有三个特征：缺陷性基因有损伤干扰性干扰辅助病毒或其他同源病毒的增殖富集性耗费其它病毒而富集自己“损人利己”,（四）病毒的变异现象,病毒突变的表现型：噬菌斑形态plaque mutants寄主范围温度敏感性：一类对高温表现敏感的突变体低温敏感性无义突变：终止突变（UAG UGA UAA）缺失突变:如DI颗粒生化特征：药物抗性、毒力变化对钝化剂的敏感性、使蛋白或核酸电泳迁移率变化等,其它性状变异(现象）毒力变异：细胞水平、机体水平、生物群体水平抗原变异 免疫原性、抗原结构、结合力培养性状变异 蚀斑、空斑形态和性质对理化因素抵抗
17、力的变异 对温度、射线、化学剂的感受性等,自然条件下不感染或不易感染的异种动物/细胞的适应性变异强毒株新宿主症状轻连续传代新宿主症状重（往往对原宿主的 毒力降低成为弱毒株）适应性变异原理：宿主细胞的选择性结果病毒对不易感宿主的适应,如流感病毒有甲乙丙三个型，其中甲型中有15个HA亚型、9个NA亚型，各个型之间往往不能相互免疫。,三、病毒变异的研究方法,（一）病毒纯化 1、蚀斑（空斑）分离法 2、病斑分离法 3、终点稀释法,选取组织消毒酶解洗涤培养单层细胞接种病毒保温培养空斑观察单斑再分离,病毒高倍稀释，如每一稀释度接种5管细胞培养物：如10-7 全有病斑；10-8中3管有病斑；10-9全无病斑
18、则10-8管为终点，有条件地认为是一个或少数几个病毒颗粒的后代。广泛用于毒株的纯化和变异株选育,（二）、获得变异株的途径,1、从自然变异中选取2、温度诱变3、辐射诱变：紫外线、X射线、r射线4、化学诱变（1）碱基替代：5-溴尿核苷、氨基嘌呤等（2）作用核酸：亚硝酸、羟胺和各种烷化剂,（三）、病毒的遗传指标,1、病毒颗粒的形态2、抗原构造及血清学性状3、蚀斑或空斑的大小和性状4、致细胞病变的特征5、病原性（包括感染范围和毒力）6、对理化因素的抵抗力7、对干扰素的敏感性,植物病毒的遗传指标,1、血清学反应2、交叉保护作用3、传播方式4、寄主范围5、症状类型6、对理化性状的稳定性,四、病毒的遗传学研
19、究,传统方法：突变体的分离及分析 分子遗传学方法：代谢抑制剂进行生化分析构建遗传图谱高分辨率电泳技术分析病毒蛋白或核酸的遗传多态性其他分子生物学技术,病毒基因功能的研究方法,互补试验 用成对病毒突变体混合感染，一种病毒为另一种病毒提供了其必需但又缺陷的基因产物，从而促进其增殖，或者两种病毒互为对方提供所必需的基因产物，能促进双方的增殖。互补过程中，感染病毒的基因型都没有改变。利用分离基因研究病毒基因功能用克隆序列进行互补试验转染后的瞬时表达,病毒表达载体,由于一些病毒可以感染动物和人类的特异组织细胞，利用这些病毒构建外源基因表达载体，用于人类一些特殊疾病的基因治疗，前景诱人。病毒载体提供了一个病毒或细胞基因进入哺乳动物细胞的极好工具。优点：能引导多拷贝目的基因进入几乎每个培养细胞。动物病毒载体既能稳定地表达基因，也能瞬时表达基因。经常用于瞬时表达的病毒载体主要来源于裂解性病毒，如：乳多空病毒、腺病毒、痘病毒和疱疹病毒等,本章要点,了解病毒突变体的类型 病毒之间的遗传互作与非遗传互作 有关概念了解病毒遗传学研究的方法,
