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1、第 六 章 微生物的遗传变异和育种,遗传：,亲代与子代相似,变异：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传和变异variation是生命的最本质特性之一,遗传型：,表型：,生物的全部遗传因子所携带的遗传信息,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,微生物的遗传变异和育种,几个相关概念,表型饰变：,表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）
2、,Production of a red pigment (prodigiosin) by Serratia marcescens. From left to right: slant culture grown at 25C, slant culture grown at 37C, broth culture grown at 25C, broth culture grown at 37C.,微生物的遗传变异和育种,几个相关概念,第一节 遗传变异的物质基础,一、三个证明DNA是遗传物质的经典实验1、经典转化实验肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力） R型（菌体无荚膜，菌落表
3、面粗糙，无致病能力）,微生物的遗传变异和育种,1928年，F.Griffth作了3组实验:,微生物的遗传变异和育种,1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子,实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA,微生物的遗传变异和育种,2、噬菌体感染实验,实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。,微生物的遗传变异和育种,3、植物病毒重建实验,实验证明，遗传信息的流向与DNA的传递是一致的。,微生物的遗传变异和育种,（一）遗传物质在7个水平上的形式1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平,微生物的
4、遗传变异和育种,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的,微生物的遗传变异和育种,1、细胞水平,真核生物 细胞核 核染色体原核生物 核区 DNA链,核基因组,在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质,微生物的遗传变异和育种,2、细胞核水平,染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构染色体的数目在不同的生物中是不同的染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的,微生物的遗传变异和育种,3、染色体水平,核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链； 环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异,微生物基因组测序工作是在人类
5、基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。,微生物的遗传变异和育种,4、核酸水平,5、基因水平,微生物的遗传变异和育种,6、密码子水平,微生物的遗传变异和育种,核苷酸是最小突变单位和交换单位,微生物的遗传变异和育种,7、核苷酸水平,（二）原核生物的质粒,1、定义质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。,微生物的遗传变异和育种,通常以共价闭合环状(covalent
6、ly closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb； 细菌质粒多 在10kb以内）,微生物的遗传变异和育种,2、结构特点,（二）原核生物的质粒,3、质粒的类型,严谨型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）,广宿主范围质粒(broad host ran
7、ge plasmid)（可以在许多种细菌中复制）,微生物的遗传变异和育种,（二）原核生物的质粒,质粒的优点：（1）体积小，易分离和操作（2）环状，稳定（3）独立复制（4）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选,微生物的遗传变异和育种,4、质粒在基因工程中的应用,（二）原核生物的质粒,5、质粒的检测,提取所有胞内DNA后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点， 如抗药性初步判断。,微生物的遗传变异和育种,（二）原核生物的质粒,6、质粒的主要种类,按照质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应分,致育因子（Fertility factor，F因子）抗性因子（R
8、esistance factor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（Metabolic plasmid）隐秘质粒（cryptic plasmid）,微生物的遗传变异和育种,（二）原核生物的质粒,（1）致育因子(Fertility factor，F因子),又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。,F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态
9、(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加(episome)。,微生物的遗传变异和育种,（2）抗性因子（Resistance factor，R因子）,包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R质粒,抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因抗性决定因子：抗性基因,微生物的遗传变异和育种,（3）产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）,微生物的遗传变异和育种,（4）毒性质粒（virulence plasmid）,许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）
10、造成伤害。,微生物的遗传变异和育种,根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子,（5）代谢质粒（Metabolic plasmid）,质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。,将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。,降解质粒：,微生物的遗传变异和育种,假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药(2,4dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟脑等的能力。,微生物的遗传变异和育种,（6）隐秘质粒（cryptic plasmid）,隐
11、秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。 它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。,在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）,微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变 遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传变化，可自发或诱导产生。,基因突变,狭义：点突变（基因突变）广义：基因突变和染色体畸变,野生型（原始性状）,基因突变,突变型（新性状）,（一）突变类型,微生物的遗传变异和育种,（二）突变率 每一世代中发生某一性状突变的几率（三）基因突变的特点 1、自发性 2、不对应性 3、稀有性
12、 4、独立性 5、可诱变性 6、稳定性 7、可逆性,微生物的遗传变异和育种,（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明,三个经典实验变量实验涂布实验影印实验,证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。,微生物的遗传变异和育种,变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,微生物的遗传变异和育种,（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明,变量
13、实验（fluctuation analysis）,微生物的遗传变异和育种,Newcombe的涂布实验（1949）,微生物的遗传变异和育种,影印实验,Joshua Lederberg,微生物的遗传变异和育种,Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,微生物的遗传变异和育种,（五）基因突变及其机制,微生物的遗传变异和育种,1、诱发突变：物理、化学和生物的因素，提高突 变率的人为的作法（1）碱基的置换,（2）移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误,（3）染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位,2、自发突变：无人为因素下的低频率突变原因（1）背景辐射（
14、2）有害产物积累（3）碱基错配,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,1、光复活作用,嘧啶二聚体,嘧啶,光解酶,微生物的遗传变异和育种,2、切除修复,（一）自发突变与育种： 选育 定向培育（二）诱变育种1、诱变育种的基本环节,微生物的遗传变异和育种,二、突变与育种,2、诱变育种的原则,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线激光离子束X射线r射线快中子,烷化剂碱基类似物吖啶化合物,微生物的遗传变异和育种,（1）使用简便有效的诱变剂,利用细菌模型了解潜在化学致癌物诱变作用的方法,“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作
15、用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。,诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用,微生物的遗传变异和育种,Ames试验介绍,美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率。,微生物的遗传变异和育种,Ames试验介绍,微生物的遗传变异和育种,Ames试验介绍,证明Ames试验重要性的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠
16、反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免，,微生物的遗传变异和育种,Ames试验介绍,（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量 剂量 = 强度（浓度） 作用时间 相对剂量 = 杀菌率（5）利用协同效应（6）寻找和利用形态、生理与产量间的相关指标（7）设计高效率筛选方案（8）根据具体情况创
17、造新型筛选方案,微生物的遗传变异和育种,3、突变株的筛选：（1）产量突变株的筛选 （2）抗药性突变株的筛选 （3）营养缺陷型突变株的筛选,突变株的筛选方法,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）,夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法,生长谱法,微生物的遗传变异和育种,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组（一）转化,供体菌,受体菌,DNA片段,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件,微
18、生物的遗传变异和育种,感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制； 人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内,微生物的遗传变异和育种,1、建立了感受态的受体细胞,（一）转化,2、外源游离DNA分子（转化因子）,转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）,微生物的遗传变异和育种,噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒,转染(transfection)：,转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；b
19、）不需要活的DNA供体细胞；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系； d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多,微生物的遗传变异和育种,（一）转化,人工转化,用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,微生物的遗传变异和育种,（二）细菌的转导（transduction）,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式 一个细胞的DNA通过病毒载
20、体的感染转移到另一个细胞中,细菌转导的类型：,普遍转导,局限转导,完全普遍转导流产普遍转导,低频转导高频转导,局限转导与普遍转导的主要区别,溶源转变,微生物的遗传变异和育种,（三）接合(conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。,微生物的遗传变异和育种,F因子的四种细胞形式,a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株
21、(“雄性”菌株)， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因 子。 细胞表面同样有性菌毛。,微生物的遗传变异和育种,1） F+F-杂交,理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株,F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。,a）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；b）F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。 c）F因子的一条链一进入
22、F-细菌中，就在F-细菌中复制新的 F因子。,d）复制完成后， F-细菌变成F+ ，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。所以最终杂交的结果是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。,微生物的遗传变异和育种,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。,2）Hfr F-杂交,Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region
23、)结合着染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。,微生物的遗传变异和育种,3）FF-杂交,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。,FF-与F+F-的不同：供体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F因子上，形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-m
24、ediated transduction）。,微生物的遗传变异和育种,（四）原生质体融合,微生物的遗传变异和育种,二、真核微生物的基因重组,细胞（ ）细胞（）,有性接合 染色体重组 新遗传型,能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交,微生物的遗传变异和育种,（一）有性杂交,（二）准性杂交,细胞（ ）细胞（）,准性接合 基因重组 新遗传型,菌丝联结 质配 核配 有丝分裂交换 单倍体杂合子,在半知菌类中最为常见,半知菌的准性生殖,微生物的遗传变异和育种,第四节 基因工程,特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性,一、基因工程,定义：在基因水平上，改造遗传物质，从而使物种发生变异，创建出具
25、有某种稳定新性状的生物新品系。,微生物的遗传变异和育种,获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物）筛选和鉴定应用,二、基因工程的基本操作,微生物的遗传变异和育种,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染； c）死亡。,微生物的遗传变异和育种,菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变,纯菌种,自发突变,不纯菌种,突变个体,传代增殖,原始个体,衰退菌种,衰退：菌种出现或表现出负变性状,1）减少传代次数；2）创造良好的培养条件；3）利用单核体传代4）经常进行纯种分离，并
26、对相应的性状指标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法；,微生物的遗传变异和育种,一）、防止衰退的措施,使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮；广义的复壮菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。 通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。,微生物的遗传变异和育种,二）、菌种的复壮（rejuvenation）,二、菌种保藏,目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用,基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种 2、尽量使
27、用分生孢子、芽孢等休眠体 3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温） 4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株,微生物的遗传变异和育种,基本方法,培养基传代培养（斜面、平板）,寄主传代培养,低温（液氮、低温冰箱）,干燥（沙土管、真空干燥）,生活态休眠态,微生物的遗传变异和育种,二、菌种保藏,微生物的遗传变异和育种,二、菌种保藏,冷冻干燥保藏法和液氮保藏法,微生物的遗传变异和育种,微生物的遗传变异和育种,思考题,1.微生物最基本的遗传物质是核酸，请简述其在7个不同层次上的存在形式？2.要想改变微生物的遗传性状，可以采取那些方法？各自的特点是那些?都有那些具体手段？3.菌株为什么会衰退？如何防止其衰退，通常我们用什么方法保藏菌株？,Thank You,图片来自网络以及本人实验室,
