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1、第五章 工业微生物育种诱变剂,5.1 物理诱变剂5.2 化学诱变剂5.3 生物诱变剂,通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。,诱发突变(induced mutation)的发现 1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变异，其效应与X射线相类似。陆续发现许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作用。近年来，随着基因工程技术的不断发展，蛋白质工程中点突变的重要技术基因诱变在菌种选育中得以应用，使生物诱变剂受到了重视，取得了可喜的发展。,诱变：,诱变剂种类,物理诱变剂,化学诱变剂,生物诱
2、变剂,诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质,诱变剂的概念与种类,什么是诱变剂？有哪些分类？,第一节 物理诱变剂,1.物理诱变剂种类2.物理诱变剂的生物学效应3.辐射引起生物效应的因素4.非电离辐射紫外线5.电离辐射6.近年来发展的新型诱变剂,1.1 物理诱变剂的种类,物理辐射,电离辐射产生正离子,非电离辐射不产生离子,X射线0.06136nm,射线0.0061.4nm,紫外线136390nm,物理诱变剂包括：紫外线，X射线，射线，快中子，射线，射线，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙射线等。,指的是能量以电磁波或粒子（如阿尔法粒子、贝塔粒子等）的形
3、式向外扩散。,高能电磁波,波长短于紫色光的肉眼不可见“光线”,辐射,1.2 物理诱变剂的生物学效应,1.辐射作用的时相阶段：物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程，通常可分为物理、物理化学、化学和生物学四个阶段。2.分子结构变化:由辐射引起DNA分子结构变化中最常发生的是DNA单链或双链断裂：单链断裂：多于双链断裂，易被修复系统修复。双链断裂：一部分也可以通过修复系统修复，但双链断裂易使染色体发生畸变或者使微生物死亡。,1.2 物理诱变剂的生物学效应,3.生物学效应与辐射类型的关系电离辐射：主要引起DNA上的基因突变和染色体的畸
4、变。非电离辐射：主要导致形成嘧啶二聚体。与辐射剂量的关系引起微生物的变异或死亡与辐射剂量成正比在相同的总辐射剂量的条件下，不论是一次连续照射还是分次累加照射，也不论是高剂量短时间照射还是低剂量长时间照射，其诱变效应基本上是相等的。,1.2 物理诱变剂的生物学效应,4.辐射作用机制直接物理作用假说间接化学作用,切尔诺贝利核爆炸,2011年3月11日爆发的9.0级特大地震影响，日本福岛核电站反应堆发生氢气爆炸,1.3 辐射引起生物效应的因素,辐射引起生物学效应的强弱既决定于微生物内在遗传因素，也受外界环境条件的影响。微生物因素:1.微生物的遗传背景:不同菌种由于遗传性状各异，对辐射的敏感性亦各不相
5、同。如：A和T比例高，对紫外线越敏感，对电离辐射则相反。2.微生物的生理状态：微生物细胞壁结构、修复系统的强弱环境因素:1.可见光：能激活光复活酶的活性，分解紫外线引起的嘧啶二聚体2.水分：含水量影响细胞对辐射的敏感性，如：含水酵母比干酵母敏感3.温度：较高的温度能促进氧气与自由基之间的作用,使射线与DNA接触过程所引起的化学反应加速4.空气或氧气：有氧比缺氧时的电离辐射效应更好,1.4 非电离辐射紫外线,136-390nm,1.4 非电离辐射紫外线,紫外线可由紫外灯管产生。要求的设备简单、操作方便、价格低廉。紫外线诱变效果显著。诱变频率高，而且不易发生回复突变。因此紫外线是一种使用最早也是沿
6、用最久的应用效果最明显的物理诱变剂。,DNA分子能吸收紫外线光谱。其中嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感上百倍。紫外线使DNA分子发生如下几种变化：DNA与蛋白质交联；胞嘧啶和尿嘧啶之间的水合作用；DNA链的断裂；形成嘧啶二聚体。这是紫外线引起的主要变化。,1.4 非电离辐射紫外线,紫外线的诱变机制和DNA损伤修复 单链上的二聚体会影响到复制时的碱基正常配对。双链上的二聚体会阻碍双链的分开，复制到这一点就无法继续进行，造成DNA链的异常。紫外线的诱变机制 形成嘧啶二聚体DNA损伤修复 光修复,切补修复（暗修复）,1.4 非电离辐射紫外线,2.紫外线诱变(1)紫外线的有效光谱DNA吸收的紫外线光谱通常为26
7、0nm，因此能诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是200300nm，最有效的波长为253.7nm(2537)。一般用来灭菌消毒的30W紫外灯管，光谱分布范围广，诱变效率较差；而15W紫外灯管产生的紫外线大约有80波长集中在2537，因此诱变效应比30W的好。(2)紫外线的辐射剂量绝对剂量：单位用erg/mm2(1 erg=10 7 J)，需要用一种剂量仪来测定，由于操作比较困难，实际工作中应用较少。相对剂量：单位用照射时间或杀菌率表示剂量决定于紫外灯的功率、灯管与被照射微生物的距离及照射时间。在灯的功率和灯管的距离固定的情况下，剂量大小则由照射时间决定。用紫外线的杀菌率表示时，一般认为909
8、9.9效果较好。,1.4 非电离辐射紫外线,(3)紫外线照射的策略：最适剂量因微生物而异，紫外照射剂量与杀菌率在一定范围内成正比。使用15W紫外灯2支，安装于镀铬灯罩内，使2537 光波集中于被处理的微生物细胞，可以提高变异率。将照射剂量提高到超致死量的程度，与可见光交替进行，利用光修复使损伤的细胞恢复，减少死亡率，增加变异幅度。一般采用30W紫外灯管，光复活的效果较好，或者在预培养基中增加一定量的咖啡因或蛋白胨，也可以降低死亡率。,2.紫外线诱变,1.4 非电离辐射紫外线,(4)紫外线诱变的步骤与方法 出发菌株：把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。前培养：营养丰富的培养基
9、+抑制修复物质，如咖啡碱或异烟肼等。霉菌、放线菌培养到绝大部分孢子刚刚萌发。制备菌悬液：离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，分散程度达9095%。要求菌悬液浓度：细菌约1108个/毫升，放线菌107108个/毫升，霉菌约106107个/毫升。,2.紫外线诱变,1.4 非电离辐射紫外线,2.紫外线诱变,紫外线照射：紫外灯预热20min，以稳定光波，边搅拌边照射，细胞均匀吸收紫外线。为避免光修复，在照射的过程中要在暗室完成，仅可打开黄色或红色灯。另据国外报道，经过紫外线诱变后的菌体可以转入到无菌试管内，并立即浸入冰水中12h，在低温的条件下，细胞内参与突变修复的各种酶类的活性受到抑制，使修复难以
10、进行。后培养：照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.52h。有些微生物在此阶段还可加入酪素水解物、色氨酸或异烟肼等物质来抑制修复。稀释涂皿：后培养物，作不同程度的稀释，进行涂板培养和筛选。,1.5 电离辐射,1.电离辐射的种类、特性与来源,X射线波长是0.06136纳米，X射线一般由X光机产生。射线的波长是0.0061.4纳米，射线来自放射性元素钴、镭或氡等。中子可以从回旋加速器、静电加速器或原子反应堆中产生 快中子具有的能量最高，为0.210MeV,电离辐射诱变机理,直接作用：打断化学键 间接作用：通过自由基打断化学键，引起缺失和损伤 效应：染色体畸变，碱基
11、置换，移码突变,1.5 电离辐射,2.电离辐射的诱变机理,1.5 电离辐射,3.电离辐射剂量X射线和射线剂量常用伦琴(R)表示，即1cm3干燥空气在0，1.013105 Pa产生2.08109离子时所需的能量。其作用机理是使原子中的电子被击出而变成正离子。由于具有很强的穿透能力，所以对细胞的杀死作用比紫外线和一般化学试剂更强。在实践中不用象紫外线那样进行反复多次照射。常用剂量掌握在杀菌率9099.9为宜，大约1万20万R。,1.5 电离辐射,3.电离辐射剂量快中子剂量常用拉德(rad)表示，指1g被照射物质吸收100erg辐射能量的射线剂量；可转换为伦琴(R)。在诱变育种中快中子照射的致死率为
12、5085较合适，产生的正突变率可达50%，采用的诱变剂量大约在1530krad。其作用机理是由中子穿过物质时把原子核中的质子撞击出来。由于快中子产生较大的电离密度，能有效地导致基因突变和染色体畸变，所以快中子对微生物诱变育种是较理想的。,1.5 电离辐射,4.电离辐射的照射方法直接对平皿上生长的菌落进行照射；用打孔器将菌落连琼脂一同取出，置于灭菌平皿内进行照射；制成菌悬液，取12ml置于试管内，浸入冰水中，从上、侧或下面进行短时间照射。低温可以降低或抑制修复酶的活性，防止突变体因修复酶的修复而还原为正常细胞。,1.5 近年来发展的新型诱变剂,1.微波：热和非热效应，分散低温干燥法消除微波热效应
13、。2.红外射线3.激光：光量子流，光微粒。4.高能电子流：较强的电离辐射线，剂量一般为杀菌率90-99.9%5.离子注入优点1：离子束与生物体作用，不仅有能量沉积，而且同时有质量沉积。能量沉积：注入的离子与生物大分子发生一系列碰撞，大分子生物获得能量时，键断裂，分子击出原子位，留下断键或缺陷，而注入离子逐步损失能量，直到能量低于100 eV为止。质量沉积：注入的离子与生物大分子结合成新分子。优点2：由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，可提供众多的诱变条件。优点3：离子注入具有作用区域的选择性、种类的多样性，其作用是局部的、可控的、可对生物体进行定点区域诱变。,化学诱变剂也可借用
14、电离辐射的方法。试管中所盛液体不能过多，否则氧气供应不足，诱变效应和重复性都比较差。电离辐射的穿透能力比较强，可以穿透玻璃等材料，而紫外线则不能穿透普通的玻璃，诱变时必须打开盖子。,值得注意的事,第二节 化学诱变剂,5.2.1 化学诱变剂的一般特点5.2.2 化学诱变剂的类型:碱基类似物 烷化剂 脱氨剂 移码诱变剂 羟化剂 金属盐类 其他化学诱变剂,2.1 化学诱变剂的一般特点,化学诱变剂往往具有专一性，对基因的某部位发生作用，对其余部位则无影响。化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。绝大多数化学诱变剂都具有毒性。,定义：一类能对DNA起作用，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质。,
15、在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进DNA分子 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的概率也高,碱基类似物是如何提高突变频率的?,2.2 碱基类似物,2.2 碱基类似物,1.碱基类似物的诱变机制以5溴尿嘧啶(5-BU)为例,碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基掺入到DNA分子中的一类化合物。主要诱变剂：5-溴尿嘧啶（5-BU）/T 2-氨基嘌呤（2-AP）/A,35,G CA=T,5-BU掺入错误,A:T G C,从上可知，由于5-BU分子结构上的5位Br原子的存在，改变了电荷的分布，影响酮式和烯醇式的平衡。,2.2 碱基类似物,2.碱基类似物的诱变处理方法
16、(以5-BU为例)(1)单独处理(2)与辐射线复合处理,据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂。,真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.11mg/ml），加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般612h)分离于平皿适温培养挑取单菌落，进行筛选。,37,（a）亚硝酸（b）羟胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍,改变碱基结构的化学修饰剂：脱氨剂、羟化剂、烷化剂 常见的碱基修饰剂,2.3 烷化剂,烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，
17、具有一个或多个活性烷基，易取代DNA分子中活泼的氢原子，与一个或多个碱基起烷化反应，改变DNA分子结构，引起突变。,双功能烷化剂,单功能烷化剂,多功能烷化剂,根据烷化剂中活性烷基的数目,亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、重氮烷类、乙烯亚胺类化合物,硫芥子、氮芥子类等,1.烷化剂定义与种类,2.部分烷化剂 和 烷化碱基,甲基磺酸甲酯,亚硝基乙基脲,7-甲基鸟嘌呤,3-甲基腺嘌呤,O6-甲基鸟嘌呤,2.3 烷化剂,2.3.1 烷化剂,1.烷化剂的作用机制(1)烷化剂主要通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。易发生烷化的位点：鸟嘌呤O6、胸腺嘧啶O4。
18、其它位点：鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2和N7、胞嘧啶N3。(2)烷化剂还可引起DNA分子中磷酸和糖之间的共价键断裂，而造成突变。,2.3.1 烷化剂,(3)烷化剂还可能使两个鸟嘌呤N7位点形成共价键。(4)一般双功能烷化剂容易引起DNA双链间的交联，造成变异或死亡。,1.烷化剂的作用机制,2.3.1 烷化剂,2.烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。见光容易发生光化学反应，保藏时要注意避光。杀菌率低而诱变效应高，如亚硝基类、磺酸酯类等。,2.3.1 烷化剂,3.常用的烷化剂(1)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合
19、于诱发营养缺陷型突变株。酸碱条件影响NTG的诱变效果，配制NTG溶液和菌悬液都要用适宜的缓冲液，如磷酸或Tris缓冲液。pH 8.0，NTG分解产生重氮甲烷；pH=6.0，NTG本身和DNA起烷化作用。,1.取新鲜的斜面，用一定pH值的缓冲液或Tris缓冲液洗下细菌制成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子（真菌或放线菌）须进行前培养，可用有关培养基代替以上缓冲液，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动阶段，经离心、洗涤，用缓冲液制成悬液，浓度约在106-107mL-1；,NTG的诱变处理方法：,2.3.1 烷化剂,3.常用的烷化剂(1)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG),2.配制NTG母
20、液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲溶液，其比例为9：1（缓冲溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml），一般NTG母液浓度配成1mg/ml。使用时取母液0.2ml，加菌悬液1.8ml，NTG最后处理浓度为100g/ml。一般处理浓度随菌种不同而异，通常细菌为1001000g/ml，而放线菌、真菌孢子为10003000 g/ml。,3.将以上菌悬液和NTG溶液混合于一试管内，置该菌生长适宜的温度下保温处理若干时间。,2.3.1 烷化剂,3.常用的烷化剂(1)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG),4.终止反应。用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去
21、药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度分离于平皿。,处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。,除以上直接以溶液处理外，也可以进行如下方法诱变处理：,1.摇瓶振荡处理2.在平皿上生长过程处理,2.3.1 烷化剂,3.常用的烷化剂(1)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG),NTG是一种强烈的致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例如用自来水大量冲洗或用12mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡过夜，洗净。,2.3.1 烷化剂,3.常用的烷化剂(1)1-甲基-3-硝基-
22、1-亚硝基胍(NTG),2.3.1 烷化剂,(2)甲基磺酸乙酯(EMS)水溶液中水解半衰期短，应现用现配；需低温、干燥保存；诱变效应最佳的酸碱条件为pH7.07.4；配制EMS和菌悬液需缓冲液，不仅影响诱变剂渗透到细胞内的速度，还影响诱变剂的稳定性。(3)硫酸二乙酯(DES)不溶于水，溶于乙醇，很不稳定；水溶液中半衰期很短，随用随配，需低温、干燥、避光保存；DES诱变效应在pH中性时效应最好。(4)乙烯亚氨溶于水，不稳定易分解，易挥发，有强烈腐蚀作用，易燃易爆，需避光、密封、低温保存；能与一个或多个碱基起化学反应，引起DNA复制时碱基错配而发生变异；在水溶液中易产生无诱变作用物质，最好采用高浓
23、度短时间处理。,3.常用的烷化剂,2.3.2 脱氨剂(以亚硝酸为例),1.诱变机制脱氨基作用引起DNA两条单链之间的交联作用,亚硝酸（nitrous acid）是典型的脱氨剂 亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，改变碱基氢键的电位，引起碱基转换而发生变异。,2.3.2 脱氨剂(以亚硝酸为例),2.亚硝酸的处理方法(1)试剂配制1mol/L pH4.5 醋酸缓冲液0.1 mol/L 亚硝酸钠溶液0.07mol/L pH8.6 磷酸氢二钠溶液(2)处理方法,2.4 移码诱变剂,移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。对噬菌体有较强的诱变作用；诱
24、发细菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更显著。吖啶化合物的诱变机制：与DNA结合后，DNA链拉长，两碱基距离拉宽，使碱基插入或缺失。吖啶黄的性质和使用方法微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，需避光保存。,2.5 羟化剂,羟胺（hydroxylamine）是典型的羟化剂 羟胺的分子式为NH2OH（简称HA）,常以盐酸羟胺形式存在（分子式为NH2OHHCl），为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性，容易吸湿，故要密封、干燥保存。羟胺是具有特异效应的诱变剂，专一地诱发G:C A:T的转换。,2.5 羟化剂,羟胺的诱变机制,改变了结构的胞嘧啶,2.5 羟化剂,根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即
25、不能使A:T G:C转换，进行逆向突变。由于羟胺是诱发G:C A:T的专一性诱变剂，因此，可以用来鉴别突变体是A:T G:C还是G:C A:T转换。羟胺的处理方法：常用浓度为0.15%，可直接在溶液中处理，时间12h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度比直接处理时低些。,2.6 金属盐类,用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。氯化锂单独使用没有明显的诱变效果，几乎都要与其他诱变剂配合处理，因此也称为助诱变剂。它在高产菌种选育史上发挥了极其显著的作用。,2.7 其他化学诱变剂,1.秋水仙碱：是诱发细胞染色体多倍体的
26、诱变剂。自1937年美国学者布莱克斯利（）等，用秋水仙素加倍曼陀罗等植物的染色体数获得成功以后，秋水仙素就被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，使具备两套染色体的母细胞无法分裂，导致多倍体产生。2.抗生素：作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素，争光霉素，丝裂霉素，放线菌素，正定霉素，光辉霉素和阿霉素等。都是抗癌药物，效果不如烷化剂，应用不广泛。,2.8 重视化学诱变剂的操作安全,2.9 小结,第三节 生物诱变剂,噬菌体基因定点诱变剂生物诱变剂的主要诱变方式,3.1 噬菌体,采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗
27、生素产量明显提高的抗性突变株。因此，可以认为这些溶源性噬菌体是一种生物诱变剂。,3.2 基因定点诱变,随着基因工程技术的发展，点突变技术在蛋白质工程中正得到广泛应用，特定寡核苷酸在突变技术中起着介导作用，使基因成为一种新的分子水平生物诱变剂。,寡核苷酸介导的定点诱变,3.3 生物诱变剂的主要诱变方式,1.转导诱发突变概念：经完全或部分缺馅噬菌体的媒介，将供体菌的小片段DNA携带至受体菌中，经配对、双交换后整合至供体菌内而获新的遗传性状之现象。烈性噬菌体：随机转导，宿主细菌的基因型发生改变；温和噬菌体：特定转导，使供体菌和受体菌都产生基因突变。,3.3 生物诱变剂的主要诱变方式,2.转化诱发突变
28、 供体菌：由细胞自溶等释 放 DNA片段；受体菌：直接吸附并吸收 供体菌DNA片段；在体内：经配对、交换与整 合成为自体基因组 的部分，再经复制 形成一个转化子.感受态：转化中受体细胞最 易接纳外源DNA片 段的一种生理状态。,3.3 生物诱变剂的主要诱变方式,1.转导诱发突变烈性噬菌体：随机转导，使宿主细菌的基因型发生改变；温和噬菌体：特定转导，也能使供体细菌和受体细菌都产生基因突变。2.转化诱发突变3.转座诱发突变,转座因子是在染色体组中或染色体组间不断改变自身位置的一段DNA序列,3.2 基因定点诱变,PCR定点诱变,课堂讨论,诱变剂在微生物育种中的作用和地位如何？诱变剂都有哪些效应？紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体对微生物有何影响？哪些修复系统可对此进行修复，其结果如何？试述各种诱变剂的作用机制。,思考题,1 四种常用的物理诱变剂的诱变机制和生物学效应是什么？2 紫外线照射剂量的表示方法有哪些？3 简述紫外线诱变的过程。4 哪些因素会影响化学诱变剂的诱变效应？5 如何用营养缺陷型回复突变测定法定性定量地测定某种化学物质的诱变作用？,今日话题,太空育种太空育种即航天育种，也称空间诱变育种，是将作物种子或诱变材料搭乘返回式卫星或高空气球送到太空，利用太空特殊的环境诱变作用，使种子产生变异，再返回地面培育作物新品种的育种新技术。,
