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1、离子注入微生物诱变育种,姜巍2013E8004161057过程所,2,离子注入微生物诱变育种,背景,特点,工业应用,具体方法,展望,背景,3,背景,离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的一种新发明。已经证实离子注入诱变,可以获得高突变率,扩大突变谱,为筛选优良的突变型菌株提供广阔的空间;同时,离子束也可以作为介质进行外源目的基因转移和转导。近十年来,人们大量研究了离子注入微生物诱变育种情况,并已获得了酶、抗生素和菌体物质等代谢产物的高产、优良菌株。探索了以离子束为介导的微生物基因组DNA 的转基因研究,使微生物基因重组育种技术得以完善和补充,拓宽了微生物育种的方法。,4,特点,1.正突变菌体的
2、高效性,离子注入诱变育种的四大特点,表明了其是一种物理效应、化学效应,是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法。它能够引起染色体的畸变,导致DNA 链碱基的损伤、断裂,从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失,大幅提高变异的频率,特点,2.菌体细胞表面刻蚀性 离子注入生物体的动量传递,可以根据直观的表面现象进行观察、研究,注入的离子就像“手术刀”对细胞表面进行刻蚀,留下非常整齐的创面。动量传递的结果引起生物组织或细胞的表面溅射,造成细胞形态的变异。具体表现到植物细胞为细胞壁减薄、细胞膜损伤,甚至大剂量时细胞破裂、死亡,6,7,特点,3 菌体存活曲线呈“马鞍型”,存活率是微生物育种中
3、常测指标,存活曲线是存活率的趋势直观表现。传统的物理、化学诱变方法(UV、-ray、EMS、DMS)均产生指数型或肩型的存活曲线,而离子注入诱变的存活曲线为先降后升再降的“马鞍型”。这说明了离子注入损伤小、突变率高的生物学效,8,特点,具体方法,离子注入装置离子注入机 中科院等离子体物理研究的一台小型的ECR离子源装置由离子源、分子泵、进气口、真空室、感应圈、靶室和束流积分仪七部分构成。具有壁溅射低、离化率高、工作寿命长、能获得高密度氧化性离子流和注入剂量测定精确等特。离子源的直流放电或高频放电产生的电子作为轰击粒子,当外来电子的能量高于原子的电离电位时,通过碰撞使元素发生电离,碰撞后除原始电
4、子外,还出现正离子和二次电子。正离子进入质量分析器选出需要的离子,再经加速器获得较高的能量,由四极透镜聚焦后进入室,进行离子注入。作量范围因注入机的不同而有差异。,9,具体方法,2 离子注入微生物的方法 微生物诱变育种,一般采用生理状态一致,处于对数生长期菌体的单细胞进行理化处理。这样才能使菌体均匀接触诱变剂,减少了分离现象的发生,获得较理想的效果。对于以菌丝生长的菌体,则利用孢子来诱变。同样,离子注入微生物育种也符合该规律,10,具体方法,首先,取培养活化的菌体种子液或斜面活化的菌苔进行稀释,一般是10-2 10-3 的稀释度,菌体浓度为108109 个PmL 为宜;然后,吸取适量的菌体稀释
5、液涂布于无菌的玻璃片(2 3 3cm)或无菌培养皿上,显微镜检验保证无重叠细胞,自然干燥(约10min)或用无菌风吹干形成菌膜;放入离子注入机的靶室(具有一定的真空度)进行脉冲注入离子。要有无离子注入的真空对照和空气对照。,11,具体方法,还有涂孢(胞)法和培养法,前者是将稀释的菌体或孢子悬液涂布于合适的琼脂平皿上,尽量减少细胞重叠,置于离子注入机靶室,抽真空进行离子注入;培养法是将菌悬液接种培养基平皿上,待长出菌落并产生大量孢子后,将平皿置于离子器靶室,抽真空后荷能离子注入诱变,常使用于具有菌丝的微生物,但是不能保证菌体的高活性。一般常用干孢法或菌膜法处理进行离子注入,且效果最佳,12,工业
6、应用,1、发酵工业上,以高产菌株为出发菌株进行诱变,提高发酵产物收率和品质,一直是工业单位的常用手段。但传统诱变方法的多次诱变往往导致负突变和抗性饱和。而离子注入却能打破此瓶颈,获得以目标产物为目的的高产、优良菌株。2、菌源性酶工程方面,离子注入诱变成功的选育了多种酶的高产菌株。,13,工业应用,3、生物工程研究领域,离子束作为介导转导外源目的DNA，在植物转基因方面已获得了表达。近几年先后得到转GUS 基因的水稻、转绿色荧光蛋白基因的小麦和转水稻几丁质酶的小麦植株。但离子注入介导转基因在微生物方面的研究甚少,宋 道军等首次报道了以离子注入为介质将耐辐射异球菌的基因组DNA 片段成功转到对UV
7、 敏感E1coli 菌株中,耐辐射异球菌菌株的外源耐辐射基因在其体内得以表达。开创了离子束转基因在微生物中的应用,使基因重组技术在微生物育种中更加完善。,14,展望,15,离子注入微生物育种具有更多的优点和发展潜力。离子注入的种类需要拓宽应用的范围,而不能只局限于几种离子(H+,N+,Ar+)。菌体细胞的前期处理,以菌膜法或干孢法为主进入真空的靶室诱变,此环境对孢子活性影响不大,但对细菌的菌体细胞活性就难以评价,何况无菌体保护剂,温度小于50,脉冲注入次数多少不一,注入时间长短因种而异。故很难保证菌体的高活性,所以注入方法需进一步探索。,展望,离子注入育种技术作为一种新兴的交叉学科,显现了巨大
8、的优势。离子注入集化学诱变和物理诱变于一身,突变率高、操作简单。加之离子束介导转基因的可能性,使其在微生物育种中更具有目的性和针对性。随着研究程度的深入,研究范围的拓宽,相信离子注入法在微生物育种中能发挥巨大的作用,16,参考文献：1 余增亮,邱励俭,霍裕平1 离子注入生物效应及育种研究进展J 1 安徽农学学报,1991,18(4):2251-2571 2 许安,姚建铭,余增亮1 离子注入维生素C 二步发酵混合菌研究(I)2-酮基-L-古龙酸高产菌系IPPM-1028 的选育J 1 工业微生物1998,28(4):21-231 3 宋道军,余汛1 离子介导转基因提高E1coli UV 敏感菌株DNA 损伤修复能力J 1 科学通报,1999,44(18):330-3341 4 宋道军,吴丽芳,陈若雷,等1N+束和-射线对两种损伤效应的J 1 激光生物学报,2000,9(2):89-1931,17,谢谢！,18,
