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1、动物细胞工程常用的技术手段：,动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、单克隆抗体动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,提问：,植物细胞工程常用的技术手段有哪些？,植物组织培养,植物体细胞杂交,烧伤病人图片,异体皮肤移植图片,思考与探究：如何用细胞培养技术，为烧伤病人植皮？,取该患者的皮肤进行细胞培养,获得足量的细胞后再移植,一、动物细胞培养,动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,(一)、选材：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。,在进行动物细胞培养时，用胰
2、蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,（二）.分散成单个细胞,1、为什么细胞培养要分散成单个细胞培养？,细胞所需的营养容易供应，代谢废物容易排除；,2、动物细胞生长特性：,细胞贴壁：,悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。,要求：,培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。,细胞的接触抑制：,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,（三）动物细胞培养过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,
3、10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,1有关概念:,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。,传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传
4、代细胞为细胞株。,细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。,细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,如何界定原代培养和传代培养？,遗传物质改变,体外细胞生长增殖过程,原代培养期（10代细胞以内）传代培养期（10代细胞以后）细胞株：（1050代细胞）细胞系：（50代细胞以后，细胞发生了癌变）,2、动物细胞培养条件：,(1)无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）,(2)营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）,化学分类,微
5、生物分类,物理分类,a.培养基的类型,天然培养基,合成培养基,固体培养基,液体培养基,选择培养基,鉴别培养基,b、为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？,血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。其中有些氨基酸动物本身不能合成，必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促帖附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%20%的血清。,动物细胞培养条件：,(1)无菌、无毒的环境（添
6、加一定量的抗生素，定期更换培养液）,(2)营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）,(3)温度和PH 36.5+（-）0.5度,7.2-7.4,(4)气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）,c、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。,独特之处有：1、液体培养基（动物体细胞大都生活在液体的环境）2、成分中有动物血清等,d、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,e、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？,胰蛋白酶除
7、了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体,培养结果,获得细胞或细胞产物,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,3、植物细胞和动物细胞培养的比较,（四）动物细胞培养应用,大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）,作为基因工程中的受体细胞,培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性,为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据,二、动
8、物体细胞核移植技术:,将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物,核移植,胚胎细胞核移植,体细胞核移植（难度高）,受体细胞：M期的卵母细胞,细胞质,细胞核,细胞核移植,多莉羊的培育过程,1、过程,供体细胞（供核）,细胞培养,体细胞,卵母细胞（减中期：供质）,去核,无核卵母细胞,注入,细胞融合,杂种细胞,构建重组胚胎,胚胎移植,代孕母体,新个体(与母体相同的个体),归纳:,1共分成两大阶段:核移植和胚胎移植,2取卵细胞作受体细胞的原因是:它是最大的细胞,易操作,它发育可直接表达性
9、状,3严格来说新个体有卵母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状,胚胎移植技术,试管动物（婴儿）培养过程,受精卵,应用前景,1、加快家畜遗传改良进程2、保护频危物种3、器官移植供体4、利用生物反应器生产生物蛋白,存在问题,成功率低存在健康问题,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。,克隆动物食品的安全问题,1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是-（）A细胞系 B细胞株 C原代细胞 D传代细胞,2、动物细胞工程技术的基础是-（）A.动物细胞融合 B.单克隆抗体 C.胚胎移植 D.动物细胞培养,A,D,3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚
10、胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）A.容易产生各种变异 B具有更强的全能性 C.取材十分方便 D分裂增殖的能力强,D,4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于-（）A.培养基不同；B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培 养成植株。,A,5、在动物细胞培养的有关叙述中，正确的是（）A动物细胞培养的目的就是为了获得大量的细胞分泌蛋白B动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理使细胞分散C细胞遗传物质的改变发生于原代培养过程中D培养至50代后继续传代的细胞是细胞株,B,6、在动物细胞培养中有
11、部分细胞可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称之为（）A原代培养 B传代培养 C细胞株 D细胞系,D,7、动物细胞培养的正确过程是（）A.原代培养传代培养细胞株细胞系 B.原代培养传代培养细胞系细胞株C.传代培养细胞系原代培养细胞株 D.原代培养细胞系传代培养细胞株,A,8、下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（）A培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清B原代培养的细胞一般传至10代左右便会出现生长停滞C动物细胞培养一般能够传到4050代，但其遗传物质发生了改变D动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量自身健康细胞,C,讨论：,1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母
12、细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。,2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？,3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗
13、？为什么？,绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。,此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,思考讨论,1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因。,细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织
14、细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。,肿瘤组织或细胞 正常组织或细胞,拓展-动物组织或细胞培养的难易程度,幼体组织或细胞 老龄组织或细胞,分化程度低的组织或细胞 分化程度高的组织或细胞,思考与探究,2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？,动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头
15、名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。,可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。,该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁
16、殖而引起种质衰退。,（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？,从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。,4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了
17、解这方面的前沿动态。,研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,三、动物细胞融合（细胞杂交）2个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法化学法,仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒,离心振动电激,聚乙二醇,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,动物细胞的融合与植物细胞之间融合,植物细胞杂交与动物细胞杂交的比较,细胞膜流动性,种间、属间、科间甚至动植物之间细胞融合都已获得成功,四、单克隆抗体,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（
18、克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。特点：特异性强、灵敏度高,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,本过程利用了哪些原理？为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量
19、单克隆抗体,单克隆抗体制备过程,单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,应用主要有：,1、临床诊断,2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,练习：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,制备单克隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,
