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1、1,应用搅拌罐式生物反应器的细胞培养技术-及其该工艺发展的远景撰稿：Vikram Gossain,Ph 编译：吴晨，NBS 公司上海代表处,2,概论,细胞培养的基本知识细胞培养的发展趋势哺乳动物细胞培养工艺的发展哺乳动物细胞培养方法之一：悬浮工艺哺乳动物细胞培养方法之二：微载体工艺哺乳动物细胞培养方法之三：固定床工艺哺乳动物细胞的大规模培养,3,细胞培养要素,生物反应器技术,表达系统-细菌-酵母-哺乳动物-真菌-植物,培养基配方 培养基的优化应该向着两个方向：-有利于细胞生长-有利于产物的制造,单位生产率,产率,工艺发展情况,4-1,细胞培养要素-第一步：选择表达系统,表达系统：细菌；酵母；真
2、菌；植物细胞；哺乳动物细胞；,4-2,细胞培养要素-第一步：选择表达系统,表达系统的发展趋势：哺乳动物细胞表达系统 原因：细胞培养技术的研究的最终目的是治疗人类疾病，而功能性哺乳动物蛋白与微生物蛋白又有区别。动物细胞中的分泌蛋白为了其功能的实现，大都是糖基化蛋白，而微生物蛋白却不是。因此，与人类细胞表达系统最相近的是哺乳动物细胞表达系统，并非是目前用的很多的微生物的表达系统。我们今天的介绍都是以哺乳动物细胞表达系统为基础的,5,细胞培养要素-第二步：确定培养基配方,培养基的优化应该向着两个方向：-有利于细胞生长-有利于产物的制造产物需要满足越来越高的国家标准或者行业标准：例如：宿主细胞DNA残
3、留：10pg（VERO细胞灭活乙脑疫苗）；牛血清残留：35ng；.注意：需要在进行生产工艺之前确定培养基的组成，如果使用了不当的培养基，在进行大规模培养工艺的过程中，会浪费许多金钱和时间。,6,细胞培养要素-生物反应器技术（基于哺乳动物细胞表达系统）,一旦表达系统和培养基都已确定好，那么你就该把注意力放在培养工艺上了。这就是下面我们所要讨论的所有内容。,7,细胞培养要素-总结,细胞培养的基本知识：选择表达系统；确定培养基配方；寻找最适生物反应器；通过分别优化这三个细胞培养的重要组成部分，使细胞培养向着更高的单位生产率和容产率这两个生产目标前进,8,细胞培养工艺发展,我们应该走那条路？,9,细胞
4、培养工艺的发展,表达系统：基于哺乳动物细胞表达系统培养基配方：根据表达系统、产物、生产力等多方面确定培养工艺和生物反应器？,10,哺乳动物细胞培养工艺的发展,第一部分：悬浮工艺第二部分：微载体工艺第三部分：固定床工艺我们需要得出：使用哪种工艺才能达到我们的细胞培养目的,11-1,哺乳动物细胞培养工艺的发展,选择反应器类型时需要考虑的因素：使用何种培养模式进行细胞培养？批次培养，半批次培养，还是连续流加培养或者灌注培养。是否有接种病毒的步骤？接种病毒后的培养模式是否需要改变？细胞密度应该维持在多少才能既满足细胞生长又满足产物的最佳产量？,11-2,哺乳动物细胞培养工艺的发展,需要多大的工作体积？
5、是否需要更换培养基？使用无血清培养基？你可能需要一种培养基可以快速增大细胞密度，然后需要另外一种培养基来使细胞更好的分泌目标产物。活细胞中最多可以承载多少个病毒的生长繁殖？（MOI）各个工艺之间有什么区别？收获的产物是什么以及怎样进行收获？,12-1,例如：连续流加培养模式,新鲜培养基,带有细胞和培养基的培养液,在这个培养模式中，你可以维持某一种化学营养组成的水平不变，如葡萄糖。可以维持最佳的细胞密度和分布状态与灌注模式的不同是它没有细胞节流装置,12-2,例如：连续流加培养模式,在这个培养模式中，你可以维持某一种化学营养组成的水平不变，如葡萄糖。可以维持最佳的细胞密度和分布状态与灌注模式的不
6、同是它没有细胞节流装置,13,哺乳动物细胞培养工艺的发展,哺乳动物细胞培养的发展目标：更高的生产力更强的放大能力（达到大规模培养）通过相关认证标准,14,哺乳动物细胞培养工艺的发展,为了达到相对灵活的目的，使用一个搅拌罐式生物反应器系统会比较合适搅拌罐式生物反应器具有以下特点：比较容易的实现大规模生产简单的达到较高的生产水平,不同细胞培养方式比较,15,哺乳动物细胞培养工艺的发展,悬浮微载体固定床,16,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺,1.适合的培养对象：悬浮细胞或者被驯化成为悬浮培养的细胞2.产物类型：细胞通常就是所需的产物3.能够稳定传代（仅有细胞培养工艺）4.病毒接种（培养细胞之外，接种病毒
7、工艺）5.适用的搅拌桨类型：倾角式或船桨式的搅拌桨6.适合的培养方式：批次培养、半批次培养工艺（加入部分营养成分）、连续灌注培养工艺7.适合的细胞培养密度：较低或者中等的细胞密度,Suspension Process:Highlights,Suspension or suspension adapted cellsCells are normally the productStable transformed(1 phase process)Viral infection(2 phase process)Cell associated virus(non-lytic viral process
8、)Pitched(PB)or marine blade impellersBatch-fed-batch perfusionLow-moderate-high density,17,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：总览,细胞密度10E6个/ml,培养模式,接种病毒后的培养模式,细胞节流装置,生产力,批次培养,半批次,灌注,灌注,灌注,半批次,半批次,半批次,灌注,灌注,旋转过滤器,中空纤维,Suspension Process:Overview悬浮工艺：总览,18-1,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：旋转过滤灌注设备,液位电极,培养基泵,收获液泵,用来控制生物反应器中葡萄糖的浓度，通过改变培养液泵将其
9、泵入生物反应器的速率来保持葡萄糖在反应器中的浓度不变,为了保持生物反应器中的工作体积大小不变，需要通过收获液泵来随时进行调节。水平传感器会将信号传给控制器，由控制器来决定是否将位于旋转过滤器中的细胞利用完的培养液泵入废液/收获液池,培养基,废液/收获液,18-2,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：旋转过滤灌注设备,用来控制生物反应器中葡萄糖的浓度，通过改变培养液泵将其泵入生物反应器的速率来保持葡萄糖在反应器中的浓度不变为了保持生物反应器中的工作体积大小不变，需要通过收获液泵来随时进行调节。水平传感器会将信号传给控制器，由控制器来决定是否将位于旋转过滤器中的细胞利用完的培养液泵入废液/收获液池,19,
10、哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：旋转过滤器,材料：不锈钢、陶瓷或者特氟龙表面尼龙丝网筛孔大小：12-14微米(通常为 5-6 m)；一般筛孔的大小为20-50微米功能：培养基从筛面通过，细胞位于筛面外；在旋转过滤笼内有汲取管，能够将笼内的培养液泵出其它组成结构：安装在同一个轴上的还有搅拌桨（小型生物反应器）或者将搅拌桨安装在另外一个轴上（大型生物反应器）,20,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：旋转过滤器,在工艺运作之外值得一提的：在对工艺运作没有影响的情况下，允许拆装和清洗灌注效率的决定：增大旋转过滤器的体积来增大可以滤过的面积，从而可以提高灌注的速率,21,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：搅拌桨,倾角式
11、搅拌桨,带一个船桨式叶轮搅拌桨的旋转过滤器,双叶涡轮式搅拌桨,细胞培养常用搅拌桨示意图说明,1.Spin Filter Impeller;旋转过滤式2.Cell-Lift Impeller;细胞提升式3.Basket Impeller;篮式4.Pitch Blade Impeller;倾角式5.Marin Blade Impeller.推进器式,22,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：旋转过滤器,灌注能力PC：在旋转过滤器无堵塞时，可以达到的灌注速率 灌注速率PR：工作人员根据实际情况设定好的灌注速率，单位：体积/天,Suspension Process:Spin Filter,Perfusion
12、Capacity(PC)=perfusion rate with no fouling of the spin filterPerfusion Rate(PR)=working volumes/day of medium exchange set by operatorIf PR PC?Irreversible fouling,can only be partially recovered Interactions between the spin filter screen and cells?Spin filter may behave similar to cross flow filt
13、ration,23,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：旋转过滤器,PR(H x D3 x 2)/(V x c)PR=灌注速率(L/day)H=被浸入的旋转过滤器的高度(cm)D=旋转过滤器的直径(cm)=旋转过滤器的角速度(RPS)V=生物反应器的工作体积(L)c=细胞密度（cells/ml）,24,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：中空纤维沉降系统,液位电极,泵1,泵3,泵2,培养基,废液/收获液,25,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：沉降系统,外形及孔径：微型过滤装置呈弹药筒型位于生物反应器外面，过滤孔为0.1-0.65微米结构：具有几个上下游压力计（测堵塞）；高流速循环泵被灌注的能力与灌注速率多层的能经
14、受住灭菌锅灭菌和原位灭菌的过程,26-1,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：利弊,优势：在批次培养工艺和半流加培养工艺中操作较易从培养的细胞中取样来判断细胞数量和活力计算病毒感染单位数有利于大规模的培养,26-2,哺乳动物细胞培养之悬浮工艺：利弊,弊端：在混合旋转过程中增大了剪切力在连续灌注培养工艺中较难操作在接种病毒后的灌注培养中，病毒会有一定流失应用血清培养基时，会产生额外的泡沫,27,哺乳动物细胞培养工艺的发展,悬浮 微载体 填充床,28,哺乳动物细胞培养之微载体工艺,适合培养的对象：贴壁细胞能够稳定传代（只培养细胞工艺）；可以接种病毒（培养细胞，然后接种病毒的工艺）；细胞释放型病毒（病毒裂解
15、工艺）搅拌桨种类：倾角式或推进器式搅拌桨；细胞提升式搅拌桨（NBS知识产权）适合的培养模式：批次-培养基更换(灌注）-连续流加适合的细胞密度：低-中等-高的细胞密度,Microcarrier Process:Highlights,Anchorage Dependent CellsStable transformed(1 phase process)Viral infection(2 phase process)Cell-released virus(lytic viral process)Pitched or marine blade impellers Cell Lift impeller(
16、NBS proprietary technologyBatch-medium exchange-perfusion Low-moderate-high cell density,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微载体,常用的球形微载体微载体类型：Cytodex 1(Pharmacia),29,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微载体,目的：为贴壁依赖细胞（ADP）提供表面积，真正的贴壁细胞是很难用悬浮培养的；表面带一定密度的正电荷，有利于细胞贴壁添加浓度：微载体的一般浓度5-15g/L（25 g/L）表面积：1g/L的微载体可提供106个/ml的细胞生长表面积比重：微载体的比重在1.03-1
17、.10之间直径：微载体的直径约为100-250微米,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微载体,但是球形微载体：1.本身“毒性”效应对细胞生长带来的不利影响;2.不可重复使用性,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微载体,这种带正电荷基团的DEAE（di-ethy1 amino ethy1 chloride）氨解交联到葡聚糖的羟基上形成串联基团的微载体使用如果超过了一定的密度，对细胞贴壁生长会产生“毒性”效应，具体表现在会有部分原始接种细胞损失掉了，并延缓了细胞贴壁时间，而微载体使用的密度越高，细胞的损失量越大，同时细胞生长也受到了抑制，严重影响细胞贴壁时间。,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微
18、载体,其“毒性”效应被认为可能是微载体吸附培养基中生长因子和关键营养物质造成的。为了降低微载体的“毒性”效应，使用了以下各种方法：用血清预处理；提高接种的细胞量，等等；另外Pharmacia公司合成的阴离子交换量为1.5ml/mg的微载体，商品名Cytodex 1，在使用中发现微载体的“毒性效应”较一般的葡聚醣表面微载体有比较大的降低，因而是当前用途广泛的微载体之一，能适应培养的细胞类型很多。,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微载体,Cytodex 1 微载体合成，是将带正电荷基团的DEAE氨解交联到葡聚糖的羟基上形成串联基团，其结构为交联葡聚糖。CH2CH3 OCH2CH2NHC1 CH2
19、CH3,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微载体,直径为120-240um的球形体每克含有5-8百万个球形微载体；为贴壁细胞提供增大的表面积 每克提供4400平方厘米表面积；微载体表面携带有正电荷有利于细胞的贴壁,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微载体,用于悬浮细胞培养时，微载体投放密度为 3-10 g/L根据反应器的特殊结构，最大微载体投放密度可达到 25 g/LCytodex-1微载体可应用于多种疫苗的生产,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微载体,*几个工艺参数：应用NBS公司30升生物反应器 与传统的转瓶工艺或者任何以往的细胞罐工艺相比较，下边的工艺参数都是前所未有的：*微载体用量：
20、25克/每升培养基*细胞密度：1.1-1.5x 107/ml*连续收获时间：病毒感染后20天以上*细胞收获总数：300400亿,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微载体,高密度的细胞培养，为连续收获高滴度、高效价的病毒上清创造了条件。以NBS公司BF4500型30升总体积，22.5升工作体积细胞罐为例，每一个工作周期（2528天），可以收获450600升高滴度、高效价病毒上清，可以制备22.5万人份IU大于4.5的人用狂犬疫苗。,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：球形微载体,我们可以制备出高质量的疫苗：以人用狂犬病疫苗为例（VERO细胞珠，巴斯德PV2061病毒珠）:宿主细胞DNA 残留:100p
21、g/每支;牛血清残留:35ng/每支;杂蛋白残留:120g/每支;内毒素:100EU/每支 成品效价:每支（0.5毫升装量）高于5.0IU.,30,在高倍的聚焦镜下看到的在5升Celligen Plus生物反应器中使用微载体Cytodex-3（胶原质材料）培养的Vero细胞第9天的情况 30,31,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：总览,细胞密度,微载体密度,细胞生长的培养模式,病毒侵染后的培养模式,带有细胞截流装置的培养模式,生产力,Microcarrier Process:Overview,32,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：旋转过滤灌注,旋转过滤器带有一个直径大到75微米的孔,液位电极,培养
22、基,废液/收获液,33,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：旋转过滤器,操作方法：与悬浮工艺的旋转过滤器有着同样的操作方法孔径：75+/-12微米特点：在悬浮培养细胞上，比拥有14微米孔的旋转过滤器的灌注速率更高,34,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：细胞提升式灌注模式（实物图）,泵1,液位电极,泵2,培养基,废液/产物,35,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：细胞提升式搅拌桨,消泡腔 105,特氟龙表面或不锈钢面,空气清洗,搅拌桨上口,通气管,空气交换腔 75,36,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：细胞提升式搅拌桨,功能1：营养供给和混合原理：搅拌桨的旋转可以在中空的搅拌桨管中形成负压，使培养基可以在封闭
23、的环形路线上形成规则的循环运动。优势：-减小剪切力-因为不存在堵塞的情况，使得营养传递拥有较高速率,37,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：细胞提升式搅拌桨,功能2：气体交换原理：通气孔设计在搅拌桨内空气交换腔后面，来提供间接的气体交换培养基可以通过筛网面，而细胞和微载体都将位于搅拌桨的外部优势：较高的供氧（率）(KLa),38,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：细胞提升式搅拌器,功能3：消除气泡原理：为了消除气泡而设计的空气转换器位于液体层的上面，在这上面，气泡被强迫通过消泡器的丝网优势：消除气泡+空气清洗,39,沉降柱,空气交换腔,消泡腔,40,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：细胞沉降系统（更多图）
24、,向下的通道,培养基+微载体入口,培养基+微载体（沉降）出口,培养基出口,向上的通道,圆锥型内置物,混合区,41,42-1,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：沉降系统,运作方式培养基+微载体通过入口被向上泵进沉降系统在沉降系统顶部，微载体和贴附于表面的细胞经过伞形装置回落此时罐内位于下部沉降系统的出口由于罐体内培养基垂直向下的轴向流动，产生向下的负压带动微载体向下运动,42-2,哺乳动物细胞培养之微载体工艺：沉降系统,小于9g/L的微载体投放密度可以获得每天1-2个工作体积的灌注率，而25g/L微载体量，并且带有两个沉降柱的系统，可以达到最大每天4-5个工作体积的灌注率,Microcarrier
25、Process:Decanter,The medium+microcarriers are pumped upwards into the decanting column via the inlet port and distributed over the upward channelsMicrocarriers are captured by sedimentation in several conical inserts along their flow path allowing for a large settling surfaceThe recovered microcarri
26、ers are mixed withthe inlet flow before exiting to the outlet port,43-1,微载体工艺：利弊,优势：1.可用于传统疫苗生产2.是一个考虑各种情况非常完善的技术3.有利于大规模培养4.配套设备有先进的细胞提升式搅拌桨和细胞沉降系统,43-2,微载体工艺：利弊,不足之处：1.玻璃生物反应器需要先被硅化2.随着高密度的球状微载体的聚集，所谓“毒性”（不利于细胞生长的成分，由微载体的聚酯糖表面产生）的问题值得关注3.在无血清培养基中，细胞可能脱落4.比悬浮培养更难操作,44,哺乳动物细胞培养之工艺发展,悬浮培养 微载体培养固定床,45
27、,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：要点,适合的使用对象：适合培养悬浮和贴壁依赖性细胞（没有必要将贴壁细胞驯化成悬浮细胞）可以稳定传代的细胞（只收获细胞或细胞分泌物的工艺）；制备病毒（细胞培养后接种病毒）释放型病毒释放在培养基内（篮式搅拌桨，NBS公司知识产权）培养模式：批次培养、培养基更换、小规模放大、带有灌注系统的大规模放大,Packed Bed Process:Highlights,Suspension and anchorage dependent cells(no need to adapt ADP cells to suspension)Stable transformed(1 pha
28、se process)Viral infection(2 phase process)Cell-released virus washed into medium(Basket impeller(proprietary technology)Batch-medium exchange large scale and perfusion mode small scale,46,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：要点,特点：高细胞密度可以使用无血清培养基或者进行培养基更换直接在生物反应器里为细胞接种病毒在接种后两天开始灌注程序 无需细胞阻挡装置固定床单位体积片状载体投放密度为100g/L片状载体是静止
29、的细胞具有三维的生长空间为细胞提供较高的生长空间（90%）,47,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：要点,每日对葡萄糖含量的监控：计算之前24小时被消耗的葡萄糖量监控新陈代谢的废物：计算乳酸和氨的产率,48,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：聚酯纤维片,50%聚酯纤维（纤维直径为16微米）（白色）50%聚丙烯提供其结构的支撑（黑）在此纤维片上生长的细胞位于纤维之间或者纤维之上,49,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：聚酯纤维片,聚丙烯纤维,聚酯纤维,电镜下图示,50,此图为电镜下EM-HEK293细胞在填充层生物反应器中的聚酯纤维片上生长的第4天,51,此图为电镜下EM-HEK293细胞在填充层生物反应器
30、中的聚酯纤维片上生长的第7天,52,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：聚酯纤维片,聚酯纤维片具有其它载体无法比拟的优势：由于细胞附着于纤维表面和之间，一般每毫升固定床体积可得到108细胞密度；它的表面积可达到 1,200-1,500 cm2/g,100mL填充体积中可加入10g片状载体5L 工作体积可提供 600,000-750,000 cm2的表面积相当于 750-880个转瓶(850 cm2)的表面积,53,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：聚酯纤维片,聚酯纤维片的处理：聚酯片和聚丙烯片通过超声波连在一起载体片的直径为6毫米，是通过打6毫米的孔得来的甲醇冲洗静电处理进行内毒素，细胞毒素，微生物含量
31、和病毒降解情况的检测制作材料获得美国专利,54,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：要点,使用聚酯纤维片针对细胞的分泌产物针对细胞裂解病毒工艺最初只是为连续灌注工艺而设计的诱导，培养和分离细胞的分泌物不需要旋转过滤器不需要沉降系统,55-1,哺乳动物细胞培养之固定床：生物反应器的设计,优势：系统的建立比较简单有较高的生产力使用对象为类似于贴壁细胞的悬浮培养在批次培养工艺，半批次培养工艺和连续流加培养工艺中都可进行操作不用设计细胞节流装置支持培养基被更换为无血清培养基,55-2,哺乳动物细胞培养之固定床：生物反应器的设计,限制：难以直接进行细胞取样难以进行细胞罐体积在300升以上的大规模培养,56,哺
32、乳动物细胞培养之固定床：篮式培养技术,搅拌罐技术,细胞固定,篮式技术,57,哺乳动物细胞培养之固定床：适合聚酯纤维片培养工艺的细胞类型,58,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：总览,细胞密度10E6个/ml,聚酯纤维片密度（g/L）,培养工艺,病毒接种后的培养工艺,细胞节流装置,生产力,59,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：灌注培养模式,液位电极,培养基,废液，培养液,碱,60-1,固定床,细胞提升搅拌桨,聚酯纤维片,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：CelliGen生物反应器的组成,60-2,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：CelliGen生物反应器的组成,Impeller Types,从左到右:旋转过
33、滤器,带有滤网和消泡腔的细胞提升式搅拌桨,细胞提升式搅拌桨，倾角搅拌桨,船桨式搅拌桨.,沉降系统,61,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：带有固定床搅拌器系统的CelliGen生物反应器罐体,62,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：接种必要的措施,直接将细胞接种到含有或者不含血清培养基的生物反应器中细胞接种密度可以在1-3 x 105/ml左右,Inoculation Requirements,Inoculate Cells Directly into the Bioreactor in Medium with or without Serum Final Cell Density 3 x 105 c
34、ells/mL 109 Total Cells for 3.5L Working Volume Bioreactor,63,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：连续流加培养步骤,连续流加开始于接种细胞后2天。而且需要监测葡萄糖的浓度水平。根据培养基中的营养物质被细胞消耗的情况来逐渐增加灌注率。新鲜培养基中需要添加葡萄糖,64,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：连续流加的安排,每日葡萄糖监测计算上一个24小时中的葡萄糖消耗量，确定葡萄糖的消耗率和调试好的泵出流体的速率来补充需要的葡萄糖的量监测代谢废物计算乳酸和氨的产出率来确定培养基和葡萄糖的添加速率。根据培养工艺更换无血清培养基,65,哺乳动物细胞培养之
35、固定床工艺：细胞生长的过程,相对于传统的搅拌桨式培养工艺，细胞滞后生长的时间会有减少相对细胞只需要15-60分钟能够完全贴附到片状载体上相对于较长时间的连续培养工艺（90天或者更长），经过10-14天就会达到稳定收获期,Kinetics of Growth,Approximately 10-14 Days to Reach Stationary Phase,66,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：培养过程结束,在连续流加工艺里，细胞或产其他产物已经收获完毕（例如制备疫苗）；如果是批次培养或者灌注培养工艺，则可以用摇动、离心或者胰酶的方法从培养床中收获细胞（例如生产抗体）,67,细胞在篮式培养罐中的
36、分布,Cell Distribution in Basket,68,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：篮式搅拌桨,搅拌桨出口,环形通气管,通气管,69,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：来自7.5L CelliGen 生物反应器的生产率列表,样本 天数 体积 抗体产出 总抗体量No.(L)(g/day)Recovered1 42 270 0.93 39.0 g2 33 250 1.02 33.7 g3 32 250 0.95 30.4 g,70-1,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：批次培养与3.5升的篮式灌注培养工艺的对比,批次培养可达到的活细胞总数 7 x 109抗体 45-75 g/ml(250 m
37、g/3.5L)136个3.5L的罐或者一个500L的罐,70-2,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：批次培养与3.5升的篮式灌注培养工艺的对比,灌注培养可达到的活细胞总数 1 x 1011培养超过42天可以获得抗体40 g 使用1000L的培养基培养28天可以得到30g的抗体,71,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：灌注培养,培养基入口管道,消泡腔（特殊的设计）,导流管,通气腔(特殊设计),环形通气管,气体入口,废培养基或收获液出口,空气清洗器（特殊设计）,细胞提升式搅拌桨,带有聚酯纤维片的篮式固定床,72,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：篮式搅拌桨,功能1：混合与物质传递原理：搅拌桨的旋转在装有搅拌桨
38、的管型容器中形成负压，使培养基在整个篮中匀速的进行环形流动。优势:-降低剪切力-能够使营养物质进行较高的混合传递,73,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：篮式搅拌桨,功能2：通气原理：环形通气管被设置在搅拌桨的下部区域-通气管和气泡回路（特殊设计）进行间接的通气优势：高氧传输效率,74,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：篮式搅拌桨,功能3：消除气泡原理：空气转移到液体上方的消泡腔，并且被强制通过消泡网优势：消除气泡+空气清洗,75,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：总览,优势：适用于悬浮和贴壁依赖细胞不需要将细胞保持在培养容器中的相关设备可以进行培养基更换很高的细胞密度及生产率大规模培养受到限制：不能进行
39、细胞取样,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：篮式搅拌桨,经过多年的推广和众多用户的努力不懈：篮式搅拌桨和已经广泛用于国内生物制品的生产例如：狂犬疫苗（人用、兽用）、乙脑疫苗、流感疫苗 血红细胞生长因子EPO；血小板细胞生长因子TPO；基因治疗药物（腺病毒）；等等,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：篮式搅拌桨：实例,VERO细胞在5L反应器中培养：VERO细胞：代次：140代，细胞形态：梭形或多边形。培养基：DMEM+2.5%胎牛血清+5%小牛血清接种细胞：10-12个3L转瓶，细胞总数为0.5-1x109cells控制参数：温度：37，搅拌速度70-100rpm,溶氧：50%，pH:7.2-7.4培养
40、时间：6-7天最大灌注量：7-9L/day。,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：篮式搅拌桨：实例,狂犬病毒株在VERO细胞中的增殖条件：*病毒株：适应VERO细胞的aG株。*接种病毒量：50-100ml,病毒滴度：LOGLD509.0-10.0/ml。*接种时间：当细胞糖代谢达到25-30g/day 或灌注量达到7-9 L/day时就可以接种病毒。*控制参数：温度：3334，搅拌速度70120rpm,溶氧：60%，pH:7.2-7.6*收获时间：洗换6-8小时后收获的上清可用于制备疫苗。,哺乳动物细胞培养之固定床工艺：篮式搅拌桨：实例,狂犬病毒株在VERO细胞中的增殖条件（续）：*培养基：采用特殊的培养基，即以常用的无血清培养基为基础培养基，添加一些成分，既可使细胞维持较长的时间，又可增加病毒的产量，提高疫苗效价，减少人血白蛋白的用量（低至100mg/L)。*收获量:35-40L。*维持时间10-13天*病毒滴度：8.0-8.5 Log LD50/ml,平均滴度 8.0Log LD50/ml*病毒效价：未经浓缩的病毒上清效价达到2-2.5IU/ml,结 束 语,美国NBS公司上海代表处的联系方法：电话：02164845955 传真：02164845933 美国NBS公司北京代表处的联系方法：电话：010-85325657 传真：010-85325658 邮箱:,76,谢谢,
