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1、,河南省,林县、安阳、新乡等,显著的地域分布差异,食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，每年死亡30万人，也是中国最常见的恶性肿瘤，排在中国恶性肿瘤死因的第四位 有显著的地域分布特征，高低发区发病率相差高达500倍,杨氏家族家庭成员:23,食管癌患者:15(65%),明显的家族聚集现象,高癌家族 林县 1965年,高癌家族 林县 2007年,环境因素复杂,遗传因素明显,食管癌的病因尚不清楚,遗传因素？,环境因素？,问题：遗传因素和环境因素究竟孰重孰轻？相互之间如何起作用？,遗传,食管癌,遗传和环境共同作用,Gene A Gene B Gene C,环境,相互作用,与遗传相关的疾病分类,遗传病
2、,单基因疾病,多基因疾病,体细胞遗传病,线粒体疾病,染色体疾病,单基因遗传病,单基因遗传病是指单一基因突变引起的疾病符合孟德尔遗传方式，所以称孟德尔式遗传病,多基因遗传病,多基因遗传病是由多个微效基因与环境因素共同作用所致,遗传方式不遵循孟德尔遗传模式,癌症糖尿病高血压冠心病精神分裂症,2003年,1953年,遗传学研究的三大里程碑,人类基因组研究第一次浪潮,2005年,多国参与的合作项目构建不同人群的高密度SNP图谱确立SNP在人群中的常见分布和传递模式每1000个碱基对中有1个SNP,个体遗传信息有99.9%是相同，差异0.1%。发现与这些差异可以了解常见疾病相关基因为揭示人类的遗传机制，
3、发现常见疾病相关基因提供方向；为发现复杂疾病易感基因提供基础数据、研究策略和先进技术,人类基因组单体型图计划（HapMap计划）,GWAS 基于“常见疾病，常见突变”学说，通过整个人类基因组来寻找常见遗传变异的可见性状间关系的研究方法,全基因组关联分析(GWAS)?,GWAS原理,原理：在一定人群中，某个等位基因或基因型在病例和对照组中存在差异，说明它与疾病有关联性,病例,对照,在病例中等位基因C的频率明显高于对照 提示：等位基因C与疾病存在一定关联性,55%,35%,45%,65%,30.25%,12.25%,20.25%,42.25%,45.5%,49.5%,GWAS举例,全基因组关联分析
4、Genome wide association study,GWAS优势,GWAS癌症研究(NG,2008-),已完成或正进行：乳腺、前列腺、肺、结直肠癌、黑色素瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、胰腺、膀胱、肾脏、卵巢癌和造血系统肿瘤等食管癌：日本1篇小样本文章尚无中国汉族人食管癌GWAS资料,“863”计划将对威胁我国人口健康的5类常见重大疾病：精神疾病、高血压、糖尿病、食管癌和肺癌 进行全基因组关联分析研究。,选择tagSNPs标记单体型,在病例-对照人群间比较SNPs等位基因频率,全基因组关联统计分析，得出有意义的SNPs,另外选择独立的病例-对照人群对初筛阶段的结果进行验证,GWAS技术路线,Ha
5、pMap计划,初筛阶段,重复验证阶段,利用芯片对所有tagSNPs进行基因分型,研究对象,中国汉族人群全部 21496 例初筛 2810 例（病例 1077例/对照 1733例）验证 18686 例（病例 7673例/对照 11013例）,入组标准,资料详实完整病例/对照为同一地区自愿参加病例组无治疗史病例组病理证实食管癌分期按UICC2007标准对照组三代亲属中无食管癌病例对照组经内镜检查除外早期食管癌不符合以上标准予以除外,资料及血样收集,45家医院：全国范围，华北为主问卷调查：统一格式采集外周静脉血,食管癌GWAS合作研究研讨会 2009.4.5-6安阳,DNA提取及标化,QIAGEN（
6、德国）基因组DNA提取试剂盒按标准程序提取每份血样的DNA准确测定每份待标化DNA的浓度 初筛浓度：50ng/l，OD值1.8-2.0 验证浓度：15ng-20ng/l，OD值1.7-2.0,基因分型和质控,初筛：Illumina Human 610-Quad芯片验证：Sequenom iPLEX 芯片具体步骤：,（6）清洁芯片（7）染色（8）芯片扫描（9）数据质控,（1）制备MSA1板（2）片段化（3）沉淀（4）重悬（5）杂交,优势技术：综合了BeadArray高密度微阵列技术和GoldenGate多通道位点特异性延伸扩增检测方案通量：一次分型的SNP位点达到55万60万,同时可以定制自己感
7、兴趣的位点,Illumina分型芯片,统计学分析,数据质控：计算样本得率、SNP得率、最小等位基因频率、哈迪温伯格遗传平衡吻合度检验对质控后的数据用Plink1.03软件分析Cochran-Armitage 趋势检验：计算P值、优势比（OR）和95%可信区间（95%CI）,初 筛,50万个SNPS,病例1077,病例 937,对照1733,对照 692,趋势检验,进入初筛,去除不匹配者,80个SNPS,18个SNPS,2个SNPS,全基因组曼哈顿图（937 病例/692对照）,选 点,选 点,18个SNPS,2个SNPS,病例 7673例/对照11013例,rs2274223,rs130423
8、95,验 证,研究了在目标SNP和基因位点处相关区域的重组和链锁不平衡类型两个易感基因分别定位 phospholipase C epsilon 1(PLCE1),10q23 chromosome 20 opening reading frame 54(C20orf54),20p13,基因定位,两个易感基因和肿瘤密切相关,PLCE1（磷脂酶基因亚运型）对多种恶性肿瘤的发生、发展、转移有促进作用C20orf54（核黄素转运基因）调节人类核黄素的转运，而核黄素缺乏是增加食管鳞状细胞癌发生的重要风险因子,PLCE1蛋白表达在不同病变组织差异显著,P=2.08E-13,阳性,阴性,结果提示,免疫组化发现
9、随食管癌变过程的进展，即正常癌前病变浸润癌各级组织中PLCE1蛋白阳性表达率逐渐升高 进一步提示：PLCE1的遗传变异在食管癌变过程中起重要作用，PLCE1可能是中国汉族人食管鳞状细胞癌的致病基因,食管癌变各阶段免疫组化染色,DYS,NOR,CIS,SCC,王立东，周福有，等,ADH1B位于4q21-23ALDH2位于12q24两个基因都与酒精代谢有关,日本食管鳞癌GWAS结果,增加食管鳞癌发病风险,下一步工作计划,增加样本量，再筛出几个易感基因将所发现的易感基因在世界各地样品进行验证，找出种族差异进行现场研究，用于食管癌早筛相关功能研究，靶向药物的研制,GWAS临床应用,GWAS,重复验证,明确基因和基因产物,确定功能,开发基因靶向治疗药物,开展个体化治疗,开发诊断试剂,为临床诊断服务,设计预防干预手段，证实基因对疾病的作用,为疾病预防提供指导,未来的发展后GWAS时代,基因与基因、基因与环境的交互作用测序：全基因组、候选区域基因表达研究蛋白产物：结构、功能动物模型研究：基因敲除、基因导入,未来临床与基础相结合,临床研究,基础研究,苏通斜拉桥,谢谢!祝大家工作顺利身体健康！,
