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1、引言,随着国民生活水平的提高，人们对生活的质量也有了较高的要求，防病于未然的健康意识逐渐被人们所重视，保健食品随之成为人们脱离亚健康的途径之一。我国的保健食品概念是1996年保健食品管理办法中的“标明具有特定保健功能的食品。即适宜于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的的食品”。具有三种属性：食品属性；功能属性(具有特定的功能)；非药品属性。然而劣质的保健食品不仅不能提高人们的生活质量，甚至威胁生命安全，因而保健食品的安全评价及质量检验是保证人们使用合格产品的前提。,保健食品的质量安全包括两方面内容：不以传统食品为载体的保健食品具有其特有的安全问题。以传统食品为载体的，要考虑相应的
2、食品安全问题，如以植物为来源的传统食品当考虑农残、植物生长刺激素等；以动物为来源则应考虑抗生素、激素等。但同时作为保健食品特有的质量安全问题，还须高度关注保健食品中加入化学药物（如违法添加芬氟拉明、麻黄素或速尿的减肥产品；又如某些“补品”检出了枸橼酸西地那非，即伟哥的主成分），各种功效成份/提取物内源性毒物安全（如中草药毒性及长期服用安全性评价），新资源、新技术、功能性安全，进口保健食品，伪劣保健食品，非法添加物的检验等问题。,鉴于保健食品于近年来暴露出的一些质量问题，中检所和药检处统一部署，扩大我所检验范围，开展对保健食品的质量监督检验工作，微生物限度作为食品药品的必检项目，显示其基础安全的
3、重要性。我室于2005、06年进行了保健食品卫生微生物学限度检验及方法学验证实验工作，完成了30多种购买样品的试检验任务，以及几个注册品种的检验，涉及口服液、片剂、胶囊、茶剂等常见保健食品类型，结合食品国标和药典探讨保健食品的检验方法及可行性，现对有检验情况汇报如下，供检验部门参考。,摘 要,我所按中国药典2005版微生物限度法及方法学验证法，对32种保健食品进行方法学验证，结果表明其中15个品种（活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养胶囊、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊、全虫草胶囊、再高铁儿童成长口服液、血尔口服液、瞳神牌轻亮、养颜鹿胎粉、梦玉胶囊、绅宁宝胶囊、博士伦博视
4、康牌叶黄素片、二月红牌红润片）分别对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有抑菌作用，染菌回收率均低于70%。结果说明：1、采用GB/T4789.14789.31 2003食品微生物限度检查法不能真实反应产品质量，因而不宜采用；2、应分别采用培养基稀释法和薄膜过滤法进行方法学验证。3、微生物限度方法学验证的必要性。,关键词,方法学验证、微生物限度、回收率、保健食品质量。,一、实验目的,确认对保健品进行微生物限度检查时，所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法是否适合于该保健品的微生物限度检查。,样品,（1）天元甘露低聚果糖液 20040701 云南绿色生物工程有限公司（2）维生素E（加州熊）040
5、902 济南生命力生物科技有限公司（3）海王金樽 040712 深圳市海王健康科技发展有限公司（4）神奇寿乐牌排铅冲剂 040210 常州市红太阳工程有限公司（5）盖中盖高钙片 20041207 哈药集团制药六厂（6）龙希膳食纤维胶囊 20030718 湖北恩施宏业魔芋开发有限责任公司（7）紫薇卵磷脂胶囊 20041119 清华紫光（集团）总公司（8）吾老七羊胎美容浓缩液 04092701 浙江蘅州市吾老七保健品有限公司（9）脑轻松胶囊 20041207 香港康富来国际企业有限公司（10）江中亮嗓胖大海 20040822 云南绿生物工程有限公司（11）江中活谓素得而乐胶囊 20041206 广
6、州蓝钥匙海洋生物工程有限公司（12）忘不了3A脑营养 20041107 山东禹王制药有限公司,（13）瞳神牌轻亮 04030101 北京轻尔特科技开发中心（14）再高铁儿童成长胶囊 20040920 广州市红虹生物科技有限公司（15）血尔口服液 20040006 香港康富来国际企业有限公司（16）金舒通胶囊 20040601-05 武汉名实医药科技有限责任公司（17）仙牌灵芝茶 20050112 四川仙牌灵芝集团有限公司（18）事轻松胶囊 20041026 武汉静悟绿色保健研究所（19）养颜鹿胎粉 040606 广东广济堂医药保健品有限公司（20）老君舒压茶 20041218 成都物华生物制品
7、有限公司（21）梦玉胶囊 20050102 济南生命生物科技有限公司（22）心态好（天一美乐宁片）031201 北京乐宁科技有限责任公司（23）华济堂牌护肝灵胶囊 20060517 美国德全高科技药业 20060521 20060525,（24）前烈立舒胶囊 QLS05222 香港奥美制药厂（25）二月红牌红润片 2007042425050 中天(上海)营养食品有限公司（26）绅宁宝胶囊 20050220、20050225香港康恩堂制药有限公司（27）博士伦博视康牌叶黄素片1515、1525、1535德国博士曼大药厂（28）全虫草胶囊 2006210 西藏天知生物科技开发有限公司（29）觉父胶
8、囊 20050307、20050327 香港奥美制药厂（30）苦瓜精华素片 3117、3500 美国GSL科技有限公司（31）宁烈宁胶囊 20050428、20050509 香港奥美制药厂（32）富威牌剑影胶囊 021333 北京富威生物科技开发公司,二、培养基,胆盐乳糖增菌液 批号：040324 玫瑰红钠琼脂 批号：050316 营养琼脂 批号：050310 营养肉汤 批号：041010 改良马丁琼脂 批号：050520 改良马丁琼脂液体 批号：040302曙红亚甲蓝琼脂 批号：040413 葡萄糖肉浸液肉汤 批号：040902EMB 批号：040413 麦康凯 批号：050608 血营养琼
9、脂 批号：050310 沙门、志贺菌属琼脂 批号：050121胰酪胨大豆肉汤 批号：050422 DHL 批号：0501274-甲基伞形酮葡萄糖苷(MUG)050127 GN 批号：040224四硫酸钠煌绿增菌液TTB 批号：040413 以上培养基均由中国药品生物制品检定所提供，另由本室本室自行配制胆盐乳糖增菌液（小倒管）10ml。,三、菌种,枯草杆菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26003、大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(F)44102、白色念珠菌(Candi
10、da albicans)CMCC(F)98001、黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98003 弗氏志贺菌（Shigella flexneri）CMCC(F)51573乙型溶血性链球菌（Hemolytic streptococcus）CMCC(F)32210沙门氏菌（Salmonella paratyphi）CMCC(B)50094,四、方法验证,1、菌液制备：（1）取经37培养18-24小时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、乙型溶血性链球菌、福氏痢疾肉汤培养物1ml+9ml盐水10倍稀释至10-5 10-7为50100CFU/ml，做活菌计数备用。（2）取经25
11、培养1824小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9 ml盐水10倍稀释至10-5 为50100CFU/ml，做活菌计数备用。（3）取经25 培养1周的黑曲霉斜面培养物，加35ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用标准比浊管比浊，与浊度相当后，取1 ml+9 ml盐水=10-1，逐管10倍稀释为10-4约50100CFU/ml，做活菌计数备用。,菌液的检验,（1）取上述金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌、乙型溶血型链球菌、福氏痢疾菌、沙门菌10-5 10-7稀释液各1ml，用45营养琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，3035培养48小时，计数，应约为50100cfu/ml。（2）取上述白
12、色念珠菌10-5 10-6稀释液及上述黑曲霉菌10-4孢子悬液各1ml，用45琥红琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，2328培养,逐日观察计数，应约为50100cfu/ml。,供试液制备,称取样品10 g，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液100ml浓度均为1：10供试液。,细菌、酵母菌及霉菌的方法学验证,（1）常规法：采用加1：10供试液1ml，分别人工接种上述5种阳性代表试验菌株，50100CFU/ml，再加1520 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2448小时观察结果细菌计数，测定回收率结果见表2。（2）培养基稀释法：采用加0.5ml、0.2 ml、0.1 ml/皿供试液，人工
13、接种上述敏感试验菌株，再加1520 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2448小时观察结果细菌计数，测定回收率。结果见表3。（3）薄膜过滤法：分别取不同品种的1：10供试液取上清夜1ml加入滤器中、用0.1%蛋白胨氯化钠稀释液冲洗300ml/滤器再加规定敏感菌株冲洗后、取出滤膜贴规定培养基培养2472小时观察结果见表4。,回收率测定：,（1）试验组：分别取不同品种的1：10供试液1 ml、50100CFU/ml 试 验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2472小时观察结果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌。（2）活菌组：测定每一菌株 加的试验菌数见表1
14、（3）供试液对照：测定供试品本底菌数（略）（4）稀释剂对照组。,回收率的计算,按如下公式计算试验组的加菌回收率：,（三）、控制菌检查方法学验证,当建立药品的微生物检查法时，应进行控制菌的方法学验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查（1）试验组 取1：10供试液，接入100 ml/瓶5瓶胆盐乳糖增菌培养基和3瓶亚碲酸盐肉汤增菌培养基中，（10 ml供试液/瓶）其中1瓶接种大肠埃希菌、福氏痢疾、沙门菌供试液瓶、稀释剂对照组瓶；其中1瓶接种乙型溶血性链球菌、供试液瓶、置35培养经2448小时结果见表5。,（2）阴性菌对照组 a 取金黄色葡萄球菌50100cfu/ml，接种 胆盐乳糖增菌培
15、养基中，置35培养经2448小时，阴性菌对照菌组为阴性（未生长）。b取大肠埃希菌50100cfu/ml，接种亚酸盐肉汤增菌培养基中置35培养经2448小时，阴性菌对照菌组为阴性（未生长）。,五、结果菌落计数表1 菌落计数,表2 微生物限度检查法验证常规法接种阳性菌株的回收率（%）,注：2331为2006年检验，控制菌全部按国标GB/T4789.14789.31 2003食品卫生微生物学检验方法进行检验从表2结果中可以看出：32个品种分别接种5株代表菌，有16个品种回收率均超过70%，可采用常规方法进行测定；另16个品种（活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养、再高铁儿童成长口服液、血尔口服液、瞳神
16、牌轻亮、养颜鹿胎粉、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、梦玉胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊、二月红牌红润片、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片、全虫草胶囊）分别对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌有抑菌作用，染菌回收率%均低于70%，应分别采用培养基稀释法和薄膜过滤法进行方法学验证。,表3 回收率小于70的品种采用培养基稀释法（0.2-0.5ml/皿）回收率（%）,从表3中结果看出,活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊等6个品种采用培养基稀释法0.2ml/皿，全虫草胶囊和富威牌剑影胶囊采用培养基稀释法0.5ml/皿，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大
17、肠杆菌回收率均超过70%，使细菌正常生长，可采用培养基稀释法测定。再高铁儿童成长口服液，养颜鹿胎粉经培养基稀释法（0.2ml/皿）测定，对枯草杆菌回收率仍低于70%；二月红牌红润片采用稀释法进行检测（0.5ml/皿）枯草杆菌回收率不稳定，均低于70%，故用薄膜过滤法进行方法学验证。而对回收率很低品种，血尔口服液、瞳神牌轻亮胶囊、梦玉胶囊、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片，可直接采用薄膜过滤法进行方法学验证。,表16结果,132个品种其中天元甘露低聚果糖液、维生素E（加州熊）、海王金樽、神奇寿乐牌排铅冲剂、新盖中盖高钙片、龙希膳食纤维胶囊、紫薇卵磷脂胶囊、吾老七羊胎美容浓缩液、脑轻松胶囊、江中
18、亮嗓胖大海、老舒君压茶、前烈立舒胶囊、觉父胶囊、苦瓜精华素片、宁烈宁胶等16个品种可采用常规法进行试验。2.活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养胶囊、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊、全虫草胶囊、富威牌剑影胶囊8个品种细菌数可采用培养基稀释法测定。3.血尔口服液、养颜鹿胎粉、再高铁童少儿成长胶囊、瞳神牌轻亮、梦玉胶囊、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片和二月红牌红润片8个品种细菌数可采用薄膜过滤法测定。,4.2005年所检的22个品种没有测定沙门菌，对于其他控制菌无抑菌活性，可采用常规法进行测定。2006年所检的10个品种其控制菌的检查，按照国标GB/T4789.14789
19、.31 2003食品卫生微生物学检验方法测定了沙门菌，除华济堂牌护肝灵胶囊采用培养基稀释法进行测定，前烈立舒胶囊、二月红牌红润片、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片、全虫草胶囊、觉父胶囊、苦瓜精华素片、宁烈宁胶囊富威牌剑影胶囊，对霉菌、控制菌均无抑菌活性，均可采用常规法进行测定。,检验结果分析,目前，保健食品按国标GB/T4789.14789.31 2003食品卫生微生物学检验方法进行检验，该标准中仅提供了一般检验方法，并没有提供方法验证的内容和要求。而保健食品中一些成分和添加剂的使用往往对微生物的生长具有抑制作用，仅依据国标（GB/T4789.14789.31 2003）方法无法去除这些因素
20、对检验结果的影响，从而无法保证结果的科学、可靠。为此采用2005版中国药典微生物限度检查方法验证的要求，对购买的34个保健食品样品进行了微生物检验的方法学验证实验，结果发现有大约50的样品具有抑菌作用（见表1），高于中成药30左右品种具有抑菌作用的比例，而且这些具有抑菌作用的品种大多可以采用培养基稀释法去除抑菌活性（见表2），也有个别品种需要采用薄膜过滤法才能去除抑菌活性（见表3），这些情况也与中成药微生物限度检查方法验证情况相似。,讨论：,仅依据国标GB/T4789.14789.31 2003食品卫生微生物学检验方法对保健食品进行微生物检验存在明显的局限性，从保障保健食品服用的安全性出发，应
21、在保健食品卫生微生物检验中进行方法的有效性确认，尤其注册检验，要充分重视方法学研究，即方法验证；同时对现有国标GB/T4789.14789.31 2003食品卫生微生物学检验方法进行必要的补充，结合中国药典的有关要求，增加阳性对照菌株和相关检查项目，采用方法大致与药品检查法相同，即常规法、稀释法和薄膜过滤法。因保健食品亦有不同程度的抑菌作用，实验前根据含有抗菌成分，选用适当方法进行实验。,参考文献,1、中国药典2005版 一部附录XIIIC 微生物限度检查法2、GB/T4789.14789.31 2003食品微生物限度检查法3、郑均镛，等 药品微生物学及检验技术.北京：人民卫生出版社，1989
22、4、中国药典 2000年版一部5、邱世翠、荣先国、邸大琳、高飞、宫照龙。黄连的体外抑菌作用研究时珍国医国药2002年04期6、刘茹玉、陈守涛。黄连等8种中药对常引起医院内感染的条件致病菌体外抗菌活性检测福建中医学院报2004年02期7、牛新华、邱世翠、邸大林、伯学柏、高飞。连翘体外抑菌作用的研究时珍国医国药 2002年06期8、段飞、张双民、杨健雄、李发荣。连翘叶提取物抑菌作用的研究西北药学杂志 2005年02期9、中药大辞典上下册 江苏新医学院编上海科学技术出版社 1985.1010、USP 28:275211、BP 2002 Apendix XVI B A315 12、JP 14th:60,
