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1、生物体内环境的稳定，不但依赖细胞增殖和分化，也依赖于细胞的凋亡。细胞凋亡（apoptosis）又称编程性死亡(PCD;Programmed Cell Death)，是生物界重要的生命现象之一。细胞凋亡是近年来生物学及医学研究的一个热点。凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，它还具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。对凋亡的研究不仅有助于对疾病过程中细胞死亡及其机制的深入阐明，而且将导致疾病新疗法的问世。,一:概述,1:细胞凋亡的研究历史,NATURE REVIEWS|MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 2|JULY 2001|545,VOGT,C.Untersuchu
2、ngen uber die Entwicklungsgeschichte derGeburtshelferkroete(Alytes obstetricians).Solothurn,Switzerland:Jent&Gassman,1842.Flemming,W.ber die bildung von richtungsfiguren insugethiereiern beim untergang graafscher follikel.Arch.Anat.Physiol.221244(1885).Terre,L.Contribution ltude de lhistolyse et de
3、lhistognse du tissu musculaire chez labeille.C.R.Soc.Biol.(IIe Srie)51,896898(1889).Kerr,J.F.R.,Wyllie,A.H.&Currie,A.R.Apoptosis:abasic biological phenomenon with wide-rangingimplications in tissue kinetics.Br.J.Cancer 26,239257(1972).,凋亡一词是1972年由澳大利亚组织病理学家John Kerr首先提出的，本意是花瓣或树叶从花或树上掉落或凋落(dropping
4、off,falling off)。1965年Kerr等结扎大鼠门脉左支，数小时内大鼠肝左叶开始出现片状坏死，但周边部分仍然由肝动脉供血而存活，几周后存活的细胞开始变小，变圆，皱缩，细胞膜将胞浆及断裂的染色质分割包围成致密的颗粒，以后被周围存活的细胞吞噬分解，在细胞死亡过程中始终保持细胞膜的完整性直到被吞噬消化为止，而且并未在局部发现炎细胞浸润。终于在1972年将这种 细胞死亡现象归为一种崭新的细胞死亡类型即凋亡。,2:细胞凋亡的概念,细胞凋亡:细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象。或者说细胞凋亡是在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。
5、由于这种死亡方 式是由基因调控的死亡过程，因此又称之为程序性细胞死亡(Programmed Cell Death)。,3:细胞凋亡与细胞坏死的区别,3:细胞凋亡与细胞坏死的区别,J Mol Med(1999)77:824833,细胞坏死:胞膜通透性增加，细胞外形发生不规变化；内质网扩张；核染色质不规则位移；线粒体及胞核肿胀；溶酶体破坏；胞膜破裂胞浆外溢；被巨噬细胞吞噬。细胞坏死引起周围炎症反应。凋亡细胞形态变化：细胞变圆，与邻周细胞脱离；胞膜表面微绒毛减少或者消失；核质固缩(Condensation)，边移(Margination)；胞浆坚实(Compactness)；细胞器集中(Squeez
6、e)；胞膜芽生(Bud)；凋亡小体(Apoptotic-body)形成，最后被巨噬细胞或者邻近吞噬细胞吞噬，或排入体腔例如腺腔及 血管腔等。这种死亡过程中，不发生溶酶体，线粒体及胞膜的破裂，没有内涵物的外泄，故不引起炎症反应及周围组织的次级损伤。,二:细胞凋亡的特征1:形态学特征,二:细胞凋亡的特征,1:形态学特征,凋亡细胞形态变化为：细胞变圆与邻周细胞脱离；胞膜表面微绒毛减少或者消失；核质固缩(Condensation)，边移(Margination)；胞浆坚实(Compactness)；细胞器集中(Squeeze)；胞膜芽生(Bud)；凋亡小体(Apoptotic-body)形成，最后被巨
7、噬细胞或者邻近吞噬细胞吞噬，或排入体腔例如腺腔及 血管腔等。这种死亡过程中，不发生溶酶体，线粒体及胞膜的破裂，没有内涵物的外泄，故不引起炎症反应及周围组织的次级损伤。,2:细胞凋亡的生物化学特征,J Clin Pathol:Mol Pathol 2000;53:5563,J Clin Pathol:Mol Pathol 2000;53:5563,J Clin Pathol:Mol Pathol 2000;53:5563,J Clin Pathol:Mol Pathol 2000;53:5563,（1）钙离子和蛋白激酶改变：细胞内Ca2+的堆积和重 新分布，细胞核内Ca2+的增多，激活核酸内切酶
8、 的活性，蛋白激酶C在不同细胞类别和不同周期活 性表现不一。（2）核酸内切酶激活把DNA内切成180碱基对倍数的核 苷酸片段，呈梯状电泳现象。（3）组织谷氨酰胺转移酶的积累并激活。（4）细胞骨架如肌动蛋白的变化。（5）细胞表面糖链、植物血凝素与玻连蛋白受体增加，磷脂酰丝氨酸的外露改变细胞表面的生化特性。,生物化学特征,NATURE REVIEWS|MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 1|NOVEMBER 2000|125,3:凋亡的阶段,J Clin Pathol:Mol Pathol 2000;53:5563,(1)信号传递包括环境因素和体内因素 通过受体介导 称为死
9、亡受体（death receptors,DR），配体（death ligands）结合激活死亡蛋白酶系（death caspase）死亡受体有肿瘤坏死因子受体基因家族，CD95（Fas或Apol）和DR（或APO）系列 肿瘤坏死因子受体基因家族，CD95（Fas或Apol）和DR（或APO）。死亡区域（death domain），参与激发蛋白酶系列和细胞产生凋亡调节机制。,(1)信号传递,(2):中央调控线粒体包括Caspases激活因子的释放，如细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、电子传递链的改变、线粒体膜电位(m)的丧失、细胞内氧化还原状的改变、Bcl-2家族促进和抑制凋亡
10、蛋白的参与等。线粒体膜通透性的改变(permeability transition,PT)线粒体内膜对细胞质中分子量1 500 kD，如质子、Ca2+、谷胱甘肽等通透性突然增加(可以通过OD540的降低或放射性标记物如蔗糖、Ca2+等检测出来)。PT孔道蛋白具有感受器的功能。NADH/NAD+、NADPH2/NADP+、pH值、二价阳离子的浓度、腺苷酸的浓度，这些参数的改变均能引起PT。,细胞色素C在凋亡中作用Cyt C是一种水溶性蛋白，位于线粒体内外膜之间，并与内膜松弛相连。在胞质核糖体上合成去血红素Cyt C，经专门途径无需信号肽、电化学势和一般的蛋白转运机制，进入线粒体内外膜之间，在得到
11、一个血红素分子后，成为完整的Cyt C,并带上正电荷而不能通过外膜。Apaf-1(apoptosis protease-activating factor 1)与Apaf-2(即释放到胞质中的Cyt C)及Apaf-3(Caspase 9)结合促进Caspase-3激活。Bcl-2对线粒体功能的调控抑制凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-XL、Mc11、Bfe1、A1等和促凋亡蛋白：Bax、Bcl-XS、Bad、Bak、Bik等，它们分布在线粒体外膜、核膜和内质网膜上。Bcl-2抑制PT的机理是阻止一些小分子如Ca2+从基质中释放以及AIF从内外膜之间释放到胞质中。,细胞色素C在凋亡中作用Bcl-2
12、对线粒体功能的调控,（3）细胞结构改变：形态变化：细胞皱缩，核致密，微绒毛消失。生化特点：多种酶活化及细胞核的改变。caspases活化的DNA酶（CAD）进入细胞核内使染色体的DNA断裂引起细胞死亡。CAD的抑制因子ICAD拮抗CAD。,三：凋亡的分子机制1：细胞凋亡的触发因子 物理因素：射线，紫外线，加热等。糖皮质激素；细胞毒药物：放射菌素，氨甲喋呤，顺铂，阿糖胞苷等。受体：APO-1/FAS抗体的受体，TCR-CD3特异抗体 的受体；引起cAMP水平升高的化合物：cAMP及其衍生物，霍乱毒素，茶碱 细胞因子TNF-及TGF-等。细胞凋亡的负性触 发因子主要是一些生长因子包括NGF，CSF
13、(G-CSF，GM-CSF)，IL(IL-2，IL-3，IL-4，IL-6)等。,三：凋亡的分子机制1：细胞凋亡的触发因子,2：凋亡基因Bcl-2(B cell lymphoma/leuklemia-2，B细胞淋巴瘤/白血病-2)基因家族。包括抑制细胞凋亡的Bcl-2、Bcl-X2、BHRF1和Bak及参与细胞存活调节的Mcl-1、A1和LMW5-HL等。人Bcl-2基因是从与滤泡性淋巴瘤相关的t(1418)染色体易位的断裂点部位克隆到。Bcl-2从其正常定位(18q-21)移位于14q-32的免疫球蛋白重链并列的位置。导致在淋巴瘤细胞中该基因的转录激活以及26kD Bcl-2 蛋白的过度表达
14、。Bcl-2基因及其表达蛋白可抑制多种组织细胞的凋亡和延长细胞寿命，故将其称为凋亡抑制其因。Bcl-2蛋日是一种与细胞器特别是线粒体膜关联的稳定蛋白，它主要位于线粒体外膜、核被膜和内质网膜。高浓度Bcl-2蛋白抑制发生凋亡细胞内质中钙离子的释放。Bcl-2是通过直接或间接地与细胞信号传递蛋白(如P53蛋白)作用而调控细胞凋亡。Bcl-2通过抗氧化作用或抑制氧自由基的产生，抑制细胞凋亡，,Bcl-2有44同源并参与调节细胞死亡的蛋白质Bcl-X。Bcl-X分2种：Bcl-XL，Bcl-XS。Bcl-XL蛋白可抑制细胞凋亡，其功能相似于Bcl-2蛋白而较弱。Bcl-Xs的作用与Bcl-2、Bcl-
15、XL相反。Bcl-Xs可能是作为Bcl-2的结构抑制子，通过对其下游的细胞凋亡调节子的作用而抑制Bcl-2的功能。Bax蛋白，与Bcl-2有21同源性。Bax蛋白有对抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用。Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，Bcl-2Bax，细胞趋于存活；BaxBcl-2，细胞趋于凋亡。因此认为Bax是极重要的促细胞凋亡基因之一。Bak是新近发现的基因，对Bcl-2有抑制作用，类似Bak/Bcl-Xs。Bak蛋白对Bcl-2的抑制作用可能是通过其它蛋白质信号传递途径中介。Bak蛋白与Bcl-XL或E1B19K蛋白形成异源二聚体。P53 P53肿瘤
16、抑制基因正常时分为野生型与突变型两种，野生型P53诱导细胞凋亡，突变型P53抑制细胞凋亡。P53是一种核内的磷酸蛋白，抑制细胞周期进程。,AJP November 2000,Vol.157,No.5,GENES&DEVELOPMENT 13:18991911 1999,C-Myc C-Myc原癌基因既有刺激细胞增生，亦有刺激细胞发生凋亡的作用。Myc蛋白与Max蛋白形成二聚体作为转录调节因子，激活介导细胞增殖的基因和诱导凋亡的基因。细胞在C-Myc基因作用下出现哪种结果，取决于细胞接受的外来信号。C-Myc基因的作用机制尚不清楚。目前认为，C-Myc可能直接参与启动凋亡，当Myc诱导细胞凋亡时
17、，细胞并不需要进入增殖周期状态。ICE(interleukin-1-converting enzyme，白介素1转换酶)基因家族 该家族成员有Ced-3、ICE、Nedd-2/ICH-1、CPP32、TX等。ICE基因家族编码蛋白酶在凋亡中发挥重要作用的蛋白酶，其作用底物有PARPpoly(ADP-ribose)polymerase，多聚ADP核糖聚合酶，U1-70kD、DNA-PK(DNA蛋白激酶)、HH1(H1组蛋白)、Lamins(层粘蛋白)、Fodrin(骨架蛋白)、actins(肌动蛋白)、PKC-(蛋白激酶C-)等。TXICECPP32死亡底物PARP早期凋亡事件。TXICECPP
18、32死亡底物PARP早期凋亡事件。,Bax是一个可溶性蛋白分子，主要位于细胞浆中，但当凋亡发生时，它从胞浆移到线粒体并与线粒体膜相结合。位于线粒体的Bcl-2确能与Bax相互作用，而后者也必须在线粒上发挥其诱导凋亡的作用。3:caspases蛋白酶:凋亡是一种进化过程中保留下来的细胞自杀，发生的机制是蛋白溶解系统活化，涉及一组半胱氨酸蛋白酶家族，称为caspases。Caspase可译为胱冬肽酶家族，是一组与线虫CED-3同源的调控哺乳动物细胞凋亡的蛋白酶家族。,蛋白酶前体可在天冬氨酸位点上被切断成3部份，H2N-端是抑制区域被移去，另一端COOH-端断裂成1大1小亚单位称为死亡区域，2大2小
19、亚单位结合成活化酶，可以作用下游效应caspases，这种级联反应称为caspases cascade。这种连锁反应的进行有赖于caspases的调节蛋白、辅助因子、反馈关系和阈限等控制。如凋亡外界信号只作用于caspases前体（procaspases），前体可活化蛋白酶激发因子（initiator of caspases），激发因子可以活化蛋白酶效应因子（effector of caspases），然后作用于底物蛋白，如核层蛋白（laminine），PARP（poly-ADP-ribos polymerase），DNA碎裂因子（DFF-45）和gelsolin等，蛋白分解引起凋亡。体内合成
20、时均以酶原（相对分子质量30 00050 000）形式存在，包括3个功能区:N端区、大亚单位（约20 000）、小亚单位（约10 000）；被激活的过程相似，即通过功能区间特异位点的蛋白酶解，继而以大小亚单位形式形成异源二聚体。,3:caspases蛋白酶,CHEMBIOCHEM 2001,2,20 29,Progress in Neurobiology 62(2000)215249,CHEMBIOCHEM 2001,2,20 29,四:细胞凋亡的调控,J.Clin.Invest.109:437442(2002).DOI:10.1172/JCI200215077.,Fas and Fasl,I
21、GF-I,NATURE REVIEWS|CANCER VOLUME 2|APRIL 2002|277,J.Clin.Invest.109:437442(2002).DOI:10.1172/JCI200215077.,NATURE REVIEWS|MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 3|FEBRUARY 2002|115,DRUG DEVELOPMENT RESEARCH 52:505507(2001),Biochemical and Biophysical Research Communications 279,307312(2000),Progress in Neur
22、obiology 62(2000)215249,Nature Immunology 3,221-227(2002),Cell,Vol.108,153164,January 25,2002,Copyright.2002 by Cell Press,Growth factor,NATURE CELL BIOLOGY VOL 4 JUNE 2002,Cancer and Apoptosis,Progress in Neurobiology 62(2000)215249,Genes transactivated by p53aGene Mechanism(s)of Actionbax Promotes
23、 mitochondrial permeability transition;promotes apoptosisIGF-BP-3 Inhibits cellular mitogenic response;promotes apoptosisp21WAF1/Cip1 Binds to cyclin-cdk complexes;inhibits cell cycle progressionGADD45 Binds to PCNA;inhibits cell cycle progression;facilitates DNA repairmdm2 Facilitates proteolytic d
24、egradation of p53;inhibits p53 transcriptional activity;faclitates p53 transport from nucleus to cytoplasm,Cell,Vol.108,153164,January 25,2002,Copyright.2002 by Cell Press,Cell,Vol.108,153164,January 25,2002,Copyright.2002 by Cell Press,五:凋亡细胞的检测方法,1:形态学技术,2:琼脂糖电泳技术,3:ELISA,4:DNA片段原位标记法,5:Caspase Activity Western blot,6:Cell Membrqne,7:流式细胞仪检测,
