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1、知识目标：掌握原生质体的分离以及培养过程理解原生质体培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术了解体细胞杂交的基本原理掌握电融合和PEG融合的基本方法。,一、原生质体培养的意义1.原生质体概念原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。,第一节 原生质体的分离和培养,核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplas
2、t)。胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。,2.意义：获得再生植株；可以远缘体细胞融合，实现体细胞杂交。,二、原生质体分离的大致步骤,用于分离原生质体的材料准备 无菌试管苗叶片，上胚轴和子叶培养细胞,预处理与酶解用黑暗处理，低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力不同植物及材料预处理的方法不同,酶解所需酶类：纤维素酶半纤维素酶果胶酶 渗透压稳定剂:A.糖溶液系统;B.盐溶液系统,酶解条件：A.一般在要求黑暗静止；难游离原生质体的材料，则置于摇床上，低速振荡。B.酶解时间：不等，一般不超过24h。C.酶解温度：25。D.加入渗透稳定剂：糖
3、溶液系统；盐溶液系统 E.酶解PH值：一般在5.6-5.8。,方法（一步法）：A.灭菌的叶片或子叶去掉下表皮，去下表皮的一面朝下放入酶液。B.悬浮细胞培养物用尼龙网筛过滤后再加入酶液中。,原生质体的收集和纯化 沉降法过滤：筛孔40-100微毫的滤网。离心：500r/min,5min。再离心：先悬浮在洗液后离心，重复三次,培养基清洗调原生质体培养密度,漂浮法常用的漂浮剂为蔗糖.梯度离心法,培养前进行原生质体活性检测,三、原生质体的培养（一）培养基1渗透压常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。2无机盐大量元素浓度；NO3和NH4+的
4、比例；Ca2+浓度,3有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。4激素常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D5pH值,(二)原生质体培养方法,1液体浅层培养 此法是先把原生质体以一定的密度悬浮在液体培养基中，用吸管将悬浮液移到直径为60cm的平皿中使之形成一个浅层。优点：培养基与空气接触面大、通气好，原生质体的代谢物易扩散，防止了有害物质积累过多而造成毒害。此外，转移培养物或添加新鲜培养基也方便，并便于观察和照相。缺点：因原生质体不易集聚而影响培养。,双层培养法固体培养和液体浅层培养相结合的方法。先将含0.7低熔点琼脂糖的固体培养基溶化后凝固于直径为6cm的培养皿内，再
5、加入2ml原生质体与培养液的均匀混合物。开始12d需经常轻微摇动，使其均匀、不集聚。该方法既具有较丰富的培养基，又不易干燥，且细胞分裂后可在固体培养基上生长和繁殖，为较好的培养方法。,平板法培养 取1ml原生质体密度为4105/ml悬浮液，与等体积已溶解的含有1.4%低熔点（40）琼脂糖的培养基均匀混合后，置于直径为6cm培养皿中，此时密度为2105/ml，待凝固后，将培养皿翻转，置于四周垫有保湿材料的直径为9cm培养皿内。用此方法得到的原生质体分布均匀，有利于定点观察，也有利于在部分材料污染时抢救未污染的部分。,(三)植板密度 原生质体培养的密度一般是1104/ml至l105/ml。(四)培
6、养条件光照 新分离出来的原生质体应在散射光或黑暗中培养。2温度 原生质体的培养温度一般为2530。,(五)原生质体的发育和植株再生 原生质体在合适的培养条件下，先再生形成新的细胞壁，然后再生细胞进行分裂形成细胞团和愈伤组织，最后通过愈伤组织或胚状体途径获得再生植株。1细胞壁再生 原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。,2细胞分裂和生长原生质体一般培养27d后开始第一次分裂，培养一周后再生细胞进行第二次分裂，之后很快进行第三、四次分裂。培养二周后，形成多细胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约六周后形成直径1 mm的小愈伤组织。,3植株再生 原生质体培
7、养形成愈伤组织以后，将其转到分化培养基上诱导器官形成或胚胎发生，使其长成完整植株。总结原生质体分离与培养,四、影响原生质体培养的因素培养基成分：KMP；N6。无机盐：降铁、增钙、降铵利于原生质体培养。渗透压稳定剂：葡萄糖最好。随胞壁再生和细胞持续分裂，其浓度须不断降低，有利生长。,激素：必需生长素和细胞分裂素，注意其配比。PH值：一般为5.6-5.8原生质密度：104-106/ml,第二节 体细胞杂交,一、植物体细胞杂交的概念 植物体细胞杂交(somatic hybridization)又称为原生质体融合(protoplast fusion)，是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方
8、法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。,原生质体融合根据其细胞融合时的完整程度可以分为两大类。(1)对称融合 对称融合(symmetric fusion)是指两个完整的细胞原生质体融合，在融合子中包含有两个融合亲本的全套染色体和全部的细胞质。,对称融合示意图,(2)非对称融合 非对称融合(asymmetric fusion)是指利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质失活后再进行融合。,非对称融合示意图,二、体细胞杂交(一)原生质体融合原生质体融合，也称体细胞杂交，就是使分离下来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，像性细胞受精作用那样互相融合成一体。,(二)原生质体融合的
9、方法及过程 1无机盐诱导融合 利用硝酸钠的作用是中和质膜的负电荷，使原生质体间不再彼此相互排斥，而紧密地结合在一起。,2聚乙二醇(PEG)与高pH-高钙相结合的诱导融合 融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。,PEG的作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。,融合技术
10、要点：融合液：CaCl2?2H2O 810mmolKH2PO4 0.7mmol甘露醇或山梨醇 0.51.0molpH 5.6诱导液：融合液PEG 2045稀释液：A液（g/100ml）pH6.0 B液（g/100ml）pH10.5,融合过程,电融合法与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。,电融合仪的结构特点：一是交变电场部分；一是高频直流电击部分,电融合的基本过程：1、细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；2、膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起,融合过程：膜融合胞质融合核融合,(五)杂种植株的鉴定,形态鉴定,分子标记鉴定,染色体原位杂交,复习思考题原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念。为什么原生质体要培养在等渗培养基中？影响原生质体培养的主要因素。原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点。如何纯化分离植物原生质体并鉴定其活力。,
