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1、陈传红 制作 2007/5,本章内容提要：原生质体培养的发展与意义原生质体的分离原生质体的培养植物细胞的融合体细胞杂种鉴定方法,陈传红 制作 2007/5,什么是原生质体（Protoplast）？,1880,Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。,Protoplast,陈传红 制作 2007/5,细 胞,陈传红 制作 2007/5,微 丝,叶绿体,线粒体,质 膜,液 泡,细胞核,内质网,微 管,细胞壁,高尔基体,植物细胞模式图,细胞壁主要成分：纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%,陈传红 制作 2007/5,一
2、、发展简史及其意义,1、发展史,1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体；1960年：英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌 纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体；1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场；1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。,陈传红 制作 2007/5,1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株。1986年：Spangenberg对单个原生质体培养获得成功。1993年：有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。主要是农作物和经济植物，如
3、大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、苹果、马铃薯、胡萝卜等；,陈传红 制作 2007/5,2、原生质体培养的意义,（1）为细胞融合奠定基础 克服有性杂交不能进行细胞质交流的不足。,陈传红 制作 2007/5,（2）是遗传工程的理想受体 能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。,Isolated protoplast are capable of ingesting foreign material into the cytoplasm.This material includes the introduction of nuclear,chloroplasts,mitochondria,DN
4、A,plasmids,bacteria and viruses.,原生质体也具有全能性,原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息动态的结合点。,陈传红 制作 2007/5,（3）理论研究,细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。,因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。必须指出：原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。,陈传红 制作 2007/5,二、原生质体分离,（一）分离方法机械法：利刃机械切割酶解法：果胶酶和纤维素酶处理,陈传红 制作 2007/5,1、机械分离（Machanical isolation）,Cut plasmolyzed tissue and subs
5、equent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell.,In practice this technique is difficult and the yield of viable protoplasts is meager.One advantage,however,is that the deleterious effects of the wall-degrading enzymes on the metabolism of the p
6、rotoplasts are eliminated.,高度液泡化的细胞,陈传红 制作 2007/5,2、酶解分离（Enzymatic isolation）,双子叶外植体/培养细胞,单子叶植物胚性细胞,2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。,陈传红 制作 2007/5,2.2 酶的种类和浓度,纤维素酶（Cellulase）Onozuka R-10果胶酶（Pectolyase）Y-23半纤维素酶（Hemicell
7、ulase）对幼叶来说，酶浓度较低：0.5-1纤维素酶，果胶酶(0.2-0.5);酶量少对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1或2。酶量大,酶液PH值：5.4-5.8因为PH高，酶活性低；PH低，原生质体损坏多,陈传红 制作 2007/5,2.3 酶液渗透压,裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作用。常用稳定剂是糖醇系统，如：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。而蔗糖等易被原生质体吸收利
8、用，降低渗透浓度，故不常用。,陈传红 制作 2007/5,2.4 材料预处理(暗处理，预培养和低温处理)在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理。原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。,陈传红 制作 2007/5,2.6 其它,酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类,保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力,2.5 酶解处理的条件光：一般黑暗下静止进行；温度：25，兼
9、顾原生质体及酶活性；时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活性，一般24小时。如烟草叶片酶处理2小时后叶肉细胞解离完毕。,陈传红 制作 2007/5,2.7 原生质体分离过程（一步法以烟草叶片为例）,第一步：预处理即对烟草植株限制供水。第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外 表皮切成4cm的小块。第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5%）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2.PH5.6。第四步：将小块烟叶放入混合酶液25 处理810小时第五步：过滤、离心、洗涤（0.7 mol甘露醇液含0.1 m mol CaCl2）。如此23次、得原生质体。,陈传
10、红 制作 2007/5,原生质体分离过程（以叶片为例）,陈传红 制作 2007/5,原生质体,叶片,原生质体,愈伤组织,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,（二）原生质体纯化,酶处后得到混合液包括：原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。原生质体纯化方法：离心沉淀法 漂浮法 接口法,陈传红 制作 2007/5,1、离心沉淀法,原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原 生质体沉于底部。步骤：第一步：原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步：离心（5001000r/min离心56min）。第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新 悬浮，再离心沉淀
11、。如此23次。第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生质 体。,陈传红 制作 2007/5,洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇，10mmol/LCaCl2 H2O,0.7mmolK H2PO4,洗涤液pH：5.6,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,2、漂浮法,原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。洗涤液：3%蔗糖+0.4mol/L甘露醇+1480mg/LCaCl2 2 H2O。或11%23%的蔗糖溶液。,陈传红 制作 2007/5,3、接口法,（以柑桔为例）,原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于
12、原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。,陈传红 制作 2007/5,（三）原生质体活力测定,1、FDA法2、TTC法3、酚藏花红染色法4、形态学观察法（以上见书 128129页）,陈传红 制作 2007/5,（四）影响原生质体数量和活力的因素,1、供试材料2、酶的种类、组合和酶解时间3、渗透压稳定剂4、质膜稳定剂5、pH值,陈传红 制作 2007/5,三、原生质体培养,一）培养方法 平板培养、液体浅层培养、固液培养,二）影响原生质体培养的因素,三）原生质体再生,陈传红 制作 2007/5,1、平板（固体包埋）培养,原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖
13、（37C左右）混合，培养于培养皿中。,（一）培养方法,陈传红 制作 2007/5,1.1 饲养层培养,方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.6%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。,方法二：X-射线杀死原生质体，与0.6%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.6%琼脂混合，培养于饲养层上。,陈传红 制作 2007/5,1.2 共培养法,将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合,前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质,陈传红 制作 2007/5,2、液体浅层培养,陈传红 制作 2007/5,3、固液共培养,
14、培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。,固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。,陈传红 制作 2007/5,（二）影响原生质体培养的因素,1、原生质体的活力2、起始密度3、渗透压稳定剂4、培养基成分5、培养条件6、植物材料和基因型,陈传红 制作 2007/5,第一次分裂,（三）原生质体再生（Regeneration）,再生细胞壁,第二次分裂,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,肉眼可见细胞团,陈传红 制作 2007/5,愈伤组织,陈传红 制作 2007/5,愈伤组织,器官发生途径胚胎发
15、生途径,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,第三节 原生质体融合 是以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善起来的一门新型生物技术，又称体细胞杂交。不同原生质体之间互相融合，发生胞质基因重组和/或核基因重组。,技术体系的3个环节：原生质体融合；选择融合体；杂种植株的再生和鉴定。,陈传红 制作 2007/5,1、原生质体融合意义,克服杂交不亲合 克服生殖器官败育 克服柑桔多胚,陈传红 制作 2007/5,2、成 就,1972年 Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种。1975年柑桔原生质体培养成功；现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原
16、生质体培养成功；木本植物中柑桔最为成功。,陈传红 制作 2007/5,番茄+马铃薯？,陈传红 制作 2007/5,3、融合方法,自发融合(Spontaneous fusion)诱发融合(induced fusion)物理和化学方法,NaNO3高pH-高Ca离子PEG电场融合,陈传红 制作 2007/5,3.1 NaNO3法,1909年：Kuster证实引起亚原生质体融合1970年：Power报道可重复控制原生质体融合1972年：Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。,NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率
17、不高。,陈传红 制作 2007/5,3.2 高pH-高Ca 离子法,1973年：Keller和Melchers用pH10.5的50 mMCaCl2溶液在37时，诱发烟草叶肉原生质体融合。,优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用。,陈传红 制作 2007/5,3.3 PEG法,PEG：Polyethylene Glycol（聚乙二醇）,1974年：Kao KN和Michayluk采用此法大大提高融合频率。1976年：Kao发现用高pH和高Ca结合融合频率更高。用高钙强碱溶液代替培养基清洗PEG。,陈传红 制作 2007/5,PEG法特点：,融合频率高可重复性强,植物+植物植物+动物动物
18、+酵母,诱发融合无特异性,毒性较低,陈传红 制作 2007/5,PEG法 原理：,PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚；在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。,陈传红 制作 2007/5,桥梁,示意图,陈传红 制作 2007/5,3.4 电融合法,Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合,电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极，一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变电场的作用下，使原生质体彼此靠近
19、、接触，排成一条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。,电融合仪,陈传红 制作 2007/5,电融合法原理：,交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。,陈传红 制作 2007/5,施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。,陈传红 制作 2007/5,原生质体融合后的培养同原生质体培养,供体-受体式细胞融合包括非
20、对称杂交和细胞质杂交两种方式。非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的少量核物质(12条染色体)和全部细胞质融合；细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。,陈传红 制作 2007/5,4、体细胞杂种细胞筛选,1）互补选择法（两次不同培养条件的培养）第一次培养条件只适合于甲亲本而不适合乙亲本，一段时间后，生存下来的是：1)未经融合的甲亲本；2)甲甲融合的产物；3)有甲亲本基因存在的甲乙融合产物。转入第二个培养条件，只适合乙亲本原生质体生长，甲原生质体死亡。两次培养之后，能存
21、活下来的只有具甲乙亲本基因并得到互补的杂种细胞。,陈传红 制作 2007/5,异硫氰酸荧光素（FITC）异硫氰酸罗丹明（RITC）分别发出绿色和红色,2）荧光染料法 两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。细胞分类器辨别和收集发两种荧光的异核体。但仪器价格昂贵，不常用。,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,5、体细胞杂种的鉴定,形态学 细胞学 遗传标记,陈传红 制作 2007/5,5-1 形态学,比较再生植株与融合亲本在形态上的异同：株高、株型、叶片大小、形状、气孔的大小与多少，花的形状、大小及颜色。,陈传红 制作 2007
22、/5,陈传红 制作 2007/5,5-2、细胞学,染色体形态和数目的比较,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,5-3、遗传标记,SSR RFLP 同工酶 RAPD AFLP,陈传红 制作 2007/5,分析所鉴定植株是否具有融合亲本的遗传物质,再生植株同时具有亲本的带；再生植株在一种情况下具有一个亲本的带，在另一种情况下具有另一个亲本的带。,陈传红 制作 2007/5,RAPD带型,陈传红 制作 2007/5,RAPD带型,陈传红 制作 2007/5,6、体细胞杂种的应用,培养抗病的新品种野生种的抗逆性转移到栽培种（马铃薯，烟草）果树上，砧木，接穗合成新材料远缘杂交，科间/
23、属间，个体的育性问题。转移细胞质基因控制的性状。,陈传红 制作 2007/5,作砧木应用,果树砧木是处于嫁接口以下的地下部分，砧木本身的果实性状对于地上部分的果实无什么影响，砧木要求抗性好，与地上部分亲和。,陈传红 制作 2007/5,1）生产无籽柚,柚为我国特色水果，栽培面积已达100万亩，其中50%为沙田柚 沙田柚品质佳，但不足在于种子多，最 多可达120粒 能能否生产无籽或少籽柚？,应用实例：,陈传红 制作 2007/5,沙田柚，我国的柚子良种，种子多,陈传红 制作 2007/5,沙田柚授以柑橘异源四倍体体细胞杂种花粉后结果状。（2000,江西赣州）,陈传红 制作 2007/5,横切面,陈传红 制作 2007/5,纵切面,陈传红 制作 2007/5,对照果实,处理果实,对照种子,处理种子,陈传红 制作 2007/5,2）筛选商用品种,NOVA+SUCCARI SOMATIC HYBRID FRUIT,陈传红 制作 2007/5,陈传红 制作 2007/5,Succari+Minneola somatic hybrid fruits,陈传红 制作 2007/5,1、简述原生质体定义。2、简述原生质体培养意义。3、简述原生质体分离、纯化方法。4、简述原生质体融合方法及原理。5、简述原生质体融合的意义。6、简述体细胞杂种鉴定方法。,作业：,
