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1、主要内容,实验室设计及无菌技术培养基及其配制外植体的选取及接种培养,一、培养基及其配制,培养基的组成成分培养基的分类培养基的配制,1、培养基的组成成分,最早 风眼兰 栅栏组织 Knop溶液+蔗糖 存活不分裂1934年 White 番茄根离体培养成功（1937年发现B族维生素的作用，创立White培养基）1948年 Skoog和崔真 烟草茎段培养 发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用培养基的组成：水、无机盐、糖、有机物、植物激素、其他添加物等。,1、培养基的组成成分,糖：碳源，维持培养基的渗透压 3%（26%）无机盐：一般有1020种，分为大量元素和微量元素两类。大量元素：N、P、S、
2、K、Ca、Mg微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo一种离子一般由一种以上的无机盐提供，以保证离子平衡，避免由于培养物吸收差异引起的pH变动。,1、培养基的组成成分,有机物：维生素类 Vit B1（硫胺素）Vit B6（盐酸吡哆醇）Vit B3（烟酸）Vit B5（泛酸钙）肌醇 氨基酸 CH（水解酪蛋白）、LH（水解乳蛋白）ME（麦芽提取物）、YE（酵母浸出物）,1、培养基的组成成分,植物激素：生长素类：诱导细胞的分裂和根的分化；IBA、IAA、NAA、2,4-D 0.1mol/L的NaOH配制细胞分裂素类：促进细胞分裂和分化不定芽 6-BA、KT、ZA、2iP 0.5或1mol/L的HC
3、l配制,1、培养基的组成成分,其他添加成分：固化剂（gelling agent）：琼脂 用量一般为7-10g/L，即0.7-1%（W/V）太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固。吸附剂：活性碳，适用于培养中容易形成不利于生长的分泌物的培养物。,pH 变动,高中化学：无机盐溶液酸碱性的判断依据是，该盐是否发生水解。强酸强碱盐如NaCl中性；强酸弱碱盐如NH4Cl酸性；强碱弱酸盐如Na2CO3碱性。大学：植物对矿质元素的吸收是以离子形式进行的，以交换吸附方式发生，阳离子和H+发生交换吸附；阴离子和HCO3-13种必需矿质元素的吸收量存在如下关系：大量元素：NKCaMg=PS；微量元素：Cl=FeM
4、nBZnCu=Mo(NH4)2SO4中，吸收量NS，培养基中H+多，生理酸性盐，pH减小KNO3中，NK，HCO3-多，生理碱性盐，pH增大。,2、培养基的分类,按性质分：基本培养基 完全培养基：基本培养基加激素按状态分 固体培养基 液体培养基,2、培养基的分类,基本培养基按照组成成分又可分为很多种，常见的如MS、Miller、B5、N6、T、LS、H、KM8P等。根据其盐浓度大致可分为四类：富盐平衡培养基：MS高硝态氮培养基：B5、N6中盐培养基：Miller，大量元素浓度为MS的一半低盐培养基：White，生根培养,3、培养基的选择,查阅文献资料，参考已有研究结果选择基本培养基 确定激素种
5、类和浓度（配方）自己实验,4、培养基的配制,（1）、母液配制：母液：实际是一种贮存液，比实际使用溶液浓度高。方便，准确。以KNO3为例：1L培养基需要量为19g，在配制母液时，增加为10倍量即190g，这样用母液配制培养基时，只要1/10的母液量就可以了。,4、培养基的配制,（1）、母液配制：一般把母液分成大量元素、微量元素、有机物等几类进行配制。大量元素配制成10-20 的母液 微量元素配制成100-200 的母液 有机一般配制成100 的母液 激素单独配制成1mg/ml的母液,4、培养基的配制,2、培养基的配制称取适量的糖（固体培养基还需要琼脂），溶解根据要配制的培养基体积按比例加入所需体
6、积的母液（如有琼脂则需煮沸至澄清）加入激素，定容（热不稳定激素需灭菌后加入）调节pH值为5.86.0（这一步一定要最后操作）,二、外植体的选取及接种培养,1、外植体（explant）的选取外植体：是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源：一是生长在自然环境下的植物；二是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物；三是无菌环境下已经过离体培养的植物。,二、外植体的选取及接种培养,1、外植体（explant）的选取根据培养需求选择植物部位 多年生植物注意树龄和季节 在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体,2、外 植 体 灭 菌,1、常用消毒剂及特点,2、外 植 体 灭 菌,消毒剂的筛选设计？,2、外 植 体 灭 菌,灭菌程序及筛选,准备室,超净台上,70%酒精 1minNaClO/HgCl2,洗45次,3、接种,用解剖刀、镊子将外植体分割成适当大小于酒精灯旁打开培养瓶盖用灭过菌的镊子将外植体接入培养基中盖培养瓶盖，注明材料、日期等信息。培养,4、培养,温度：24左右 一般材料2030光照：初期弱光，后期强光；光周期一般1216小时气体调节（O2）：,
