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1、一、目的 1、学习并掌握食品中菌落总数测定方法和原理。2、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。,二、原理,细菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：菌落总数和细菌总数。,1、菌落总数 是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中形成的细菌菌落总数。以 CFU/g（mL）来表示。一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、pH、是否需要氧气等。,按国家标准方法规定，即在需氧情况下，36 1培养482 h，能在平板计数琼脂上生长发育的细菌菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。,菌落总
2、数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。,2 菌落总数测定的卫生学意义（1）菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。,（2）食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。,3、细菌总数 指一定数量或面积的食品样品经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其
3、中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1 g或1 mL样品中的细菌总数来表示。,三、材料,1、食品检样 2、培养基 平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 3、其它 无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培养箱等。,四、流程,1、检样 2、做几个适当倍数的稀释液3、选择23个适宜稀释度各1 mL,分别加入灭菌平皿内 4、平皿内倾注1520 mL琼脂培养基，混匀 5、36 1培养482小时或（242）小时6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量7、计算菌落总数 报告,五、步骤,(一)取样、稀释和培养 1、以无菌操作取检样25g（mL），放于225mL灭菌生理盐水或磷
4、酸盐缓冲液 的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体和半固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理12min，制成1:10的均匀稀释液。,2、用1 mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管或反复吹打混合均匀，制成1:100的稀释液。,3、另取1 mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1 mL吸管。,4、根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以
5、吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1ml稀释液（不含样品）加入两个灭菌平皿内作空白对照。,5、稀释液移入平皿后，将冷却至46琼脂培养基注入平皿约1520ml，并转动平皿，混合均匀。,6、待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h，水产品301温箱内培养723h。如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固后培养。,（二）菌落记录方法 做平板菌落数记录时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。到达规定培养时间，应立即
6、计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不要超过24h。,1、平皿菌落数的选择 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿，大于300的可记为多不可计。,2、其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。,3、当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。,（三）菌落总数
7、的计算 1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。,2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，应以两者比值决定。若其比值小于2，应报告两者的平均数；若大于等于2，则报告稀释度较小的菌落数。,3、若所有稀释度的平板菌落数均300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,4、若所有稀释度平板菌落数均30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。5、若所有稀释度平板均无菌落生长，则应按1乘以最低稀释倍数计算。,6、若所有稀释度均不在30300之间，有的300，有的又30，则应以最接近
8、300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,（四）菌落计数报告方法,1、菌落数在1100时，按四舍五入报告两位有效数字。2、菌落数 100时，第三位数字按四舍五入计算，取前面两位有效数字，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。,3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。4、若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。5、称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。,注意事项,1、无菌操作 操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应
9、当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。,2、采样的代表性 如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。,3、稀释液 样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或磷酸盐缓冲液（或0.1蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。,4、每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。5、倾注用培养基应在46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。,6、倾注培养基的量规定不一，从1220ml不等，一般
10、以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。,7、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。,8、培养温度一般为37（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15。,9、为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可
11、同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4环境中放置，以便计数时作对照观察。,六、结果,1、将实验测出的样品数据以表格的方式报告。2、对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。,报告方式,七、思考,1、什么是细菌菌落总数（cfu）？2、细菌菌落总数测定的卫生学意义是什么？3、倒培养基后，为什么要倒置培养？4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在461的温度？,酱油（GB/T2717-2003）：细菌菌落总数：30000 CFU/mL大肠菌群：30MPN/100mL肠道致病菌：不得检出,全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）：特级 一级 二级细菌菌落总数：20000 30000
12、50000（CFU/ml）大肠菌群 40 90 90（MPN/100g）肠道致病菌：不得检出 不得检出 不得检出,巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：30000 CFU/mL大肠菌群：90 MPN/100mL肠道致病菌：不得检出,生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数cfu/ml：100总大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出耐热大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出大肠埃希氏菌cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出,瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准(GB 17324-2003)细菌菌落总数cfu/ml：20大肠菌群MPN/100ml：3致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出,
