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1、植物病毒概述,病毒(virus)是一种由核酸、蛋白或其复合体构成的，可以增殖、传染和寄生在其他生物体上的非细胞形态分子生物病毒区别于其它生物的主要特征是：1.病毒是个体微小的分子寄生物，其结构简单；2.专性寄生物，其繁殖需要寄主提供原料和场所。按寄主的性质不同，病毒分为寄生植物的植物病毒(Plant virus)、寄生动物的动物病毒以及寄生细菌的噬菌体等。,植物病毒的危害及作用,病毒引起的病害在数量上占植物病害的第二位。由植物病毒引起的植物病害的植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫芦科等。在鲁西北引起毁灭性的植物病毒病有番茄蕨叶病毒病，花叶病毒病，辣椒花叶病毒病和烟草脉坏死病毒病等。生产上
2、危害较大的植物病毒病害有：烟草花叶病、黄瓜花叶病、马铃薯病毒病、玉米矮花叶病等。植物病毒也有可利用的价值，特别在开发基因工程的载体、转基因植物研究等方面，发挥了很大的作用。,植物病毒学研究历史,1886年梅耶尔(Mayer)证明了烟草花叶病害的摩擦传染性;1892年伊凡诺夫斯基(Ivanowski)发现了烟草花叶病的病原可以通过细菌过滤器；1898年伯吉林克(Beijeincku)又发现该病原不是微生物，而是一种传染性活液(contagium vivum fluidum)，这就是Virus一词的来源；1935年，美国科学家斯坦利（Stanley）获得了烟草花叶病毒的蛋白结晶,认为病毒是可在活细
3、胞内增殖的蛋白（1946年获Nobel Prize in Chemistry)。,植物病毒学研究历史,1936年英国科学家鲍登(Bawden)证明提纯的TMV中含有核酸；l939年Kausch通过电子显微镜观察到植物病毒的形态；1956年Gierrer 证明去掉蛋白质的RNA起重要侵染和增殖作用；1971年Diener 发现了很小的RNA（250-400bps)称为类病毒（viroid);1982年发现仅有蛋白质的朊病毒,植物病毒学研究历史,1981年，A.Lwoff在巴黎举行的第五届病毒学大会上，这一法国病毒研究所所长阿尔沃夫，认为病毒不是生物，他的观点如下：生长和分裂 独立进化 独立的生命
4、体原 生 生 物 细 胞 线粒体和叶绿体 膜 染色体、原质体含核酸 病 毒 综上所述，认为病毒是有机物，而不是生物。,第一节 植物病毒的形态、结构与组分,一、植物病毒的形态,观察需要电子显微镜，度量尺度为纳米(nm)。植物病毒的基本形态为球状、杆状和线条状。球状病毒的直径大多在20一35nm，少数可以达到70-80nm，球状病毒也称为多面体病毒或二十面体(icosahedral particle)病毒。杆状病毒多为20-80nm100-250nm，两端平齐；少数两端钝圆，线状病毒多为1113nm 750nm，个别可以达到2000nm以上。还有少数病毒与以上形态不同，它们有的看上去是两个球状病毒
5、联合在一起，被称为双联病毒(或双生病毒)；有的像弹头，被称为弹状病毒；还有的呈丝线状，柔软不定形。,二、植物病毒的结构,中间核酸，外为蛋白质衣壳，由许多蛋白质亚基组成，核酸和蛋白质亚基均呈螺旋状排列。杆状或条状病毒的粒体是空心的。TMV为棒状，CMV球状的。球状病毒：20面体，蛋白质亚基为60个或60的倍数，蛋白质亚基在每个面上不呈螺旋状排列，镶嵌在表面，粒体中心也是空的。核酸链排列还不清楚。,三、植物病毒的组分,植物病毒主要成分是核酸和蛋白质，核酸在内部，外部由蛋白质包被，称为外壳，有的病毒粒体中还含有少量的糖蛋白或脂类。构成病毒的成分：核酸5-40%，蛋白质60-95%，还有水分和矿物质等
6、。类病毒和拟病毒无蛋白衣壳，无专化性血清学反应，真病毒有专化性血清反应。,（一）蛋白质,一般植物病毒RNA基因组的翻译产物只有47种，最多12种，这些产物包括病毒的衣壳蛋白，复制酶，运动蛋白、传播辅助蛋白、蛋白酶等。蛋白多肽链经过三维折叠形成衣壳的基本结构单位，称为蛋白质亚基，进而形成壳基。壳基是一种形态单位，主要表现在球形病毒上，多数壳基形成衣壳。植物病毒衣壳蛋白具有良好的抗原特性，能刺激动物产生抗体，并和抗原发生反应，是血清学方法鉴定病毒的依据。,（二）核酸,核酸是病毒的核心，组成了病毒的遗传信息库-基因组决定病毒的增殖、遗传、变异、和致病性1.植物病毒的核酸类型（1）正单链RNA（+ss
7、RNA).其单链RNA可以直接翻译蛋白质，起mRNA的作用 TMV、PVX、PVY（2）负单链RNA病毒（-ssRNA）。不能起RNA的作用，必须先转录成互补链。WRDV（3）双链RNA(dsRNA)MRDV(4)单链DNA（ssRNA）单链先合成双链，以常 规途径转录mRNA(5)双链DNA（dsDNA）CaMV花椰菜病毒,2.病毒核酸的比例,球形病毒的核酸含量高，占粒体重量的15%-45%，长条形病毒中占5%-6%；而在弹状病毒中只占1%3.核酸的多分体现象多分体现象为植物病毒所特有，并仅存于正单链RNA中，核酸的多分体现象是指病毒的基因组分布在不同的核酸链上，分别包装的不同的病毒粒体中。
8、所以单个病毒粒体不能完成侵染。这种分段的基因组称多组分基因组；含多组分基因组的病毒称多分体病毒。正单链RNA病毒根据基因组的分离和侵染必须的状况又分为单分体病毒TMV、PVX、PVY双分体病毒：烟草脆裂病毒和蠕传病毒三分体病毒：CMV，有四条核酸链，但包被在三个或四个病毒粒体中。,4.卫星RNA,在某些多分体病毒中发现了小分量的RNA 其与病毒RNA无同源性，单独不具有侵染性，要依赖病毒的核酸才能侵染和增殖这种核酸称为卫星RNA（sRNA）,其依赖的病毒称为辅助病毒；它们包被在同一衣壳内，并抑制辅助病毒的复制，降低其浓度，并改变其致病力，可利用生物防治及基因工程抗病育种。,（三）其它组分,水分
9、、糖蛋白或脂类、精胺和亚精胺金属离子,第二节 植物病毒的复制和增殖,DNA-RNA-蛋白质，按中心法则进行，由于病毒结构简单，因此，增殖不同于普通细胞。主要是进行复制，转录和翻译。遗传：病毒侵入后，蛋白质衣壳和核酸分开，核酸利用寄主细胞的物质和能量合成负模板，再利用负模板拷贝出大量DNA，再转录成mRNA，再翻译成蛋白质衣壳，最后组装成病毒粒子。变异：病毒每个变异类群称为一个株系，是病毒种以下的分类单位。自然界中病毒的株系有自然发生突变和人工诱变的两类，射线，射线，高温，亚硝酸等均可引起变异。,第三节、植物病毒病的症状特点,一、外部症状(Symptom)：病毒病害在症状表现上多为系统发病，表现
10、为变色、畸形少数引起坏死、腐烂，萎蔫极少发生。变色：花叶(mosaic)，黄化(yellow)。坏死(negrosis)：也称作枯斑反应，如TMV侵染心叶烟表现为坏死枯斑，马铃薯病毒的某些株系侵染烟草可产生脉坏死。畸形：抑制型：矮化(dwarf)，卷叶(leafroll)，皱叶(rugose)，蕨叶(fernleaf)。刺激型：丛生(rosette)，肿瘤(tumor)。,第三节植物病毒病的症状特点,二、病组织的内部和细胞的变化：1.组织变化：组织坏死：如烟草花叶病毒TMV，它侵染心叶烟引起薄壁组织坏死，有些引起茎部维管束和叶部坏死，烟草花叶病毒侵染大豆引起顶芽和侧枝坏死。一般引起黄化类型的病
11、毒病多是因输导组织、韧皮部坏死引起。组织增生：病毒侵染后，寄主植物体内代谢失调，产生激素，引起增生。,第三节.植物病毒病的症状特点,2.细胞的变化：花叶和斑驳是由于细胞内叶绿素遭到破坏所致。内含体(inclussion)：某些植物被病毒侵染后，在病组织中产生的一种特殊结构，存在于细胞质或细胞核中，在显微镜下可以观察到。分为不定型内含体体和结晶体。结晶体：有六角型、长条型、正四面体型等，个别的还有皿状，无色透明，主要是由病毒粒体和寄主的蛋白质有规则地排列形成。,第三节植物病毒病的症状特点,体：无一定形状，半透明，通常外有一层膜，也是由病毒粒体和寄主物质构成。内含体的作用：植物患病毒病后才有，因此
12、，可作为一种诊断的指标。但并不是所有的病毒病都有内含体，有些必须发育到一定阶段才形成，同时一种病毒还可有多种形态的内含体，因此，单靠内含体诊断还有一定的局限性。,第三节植物病毒病的症状特点,三、患病植物的生理变化：表现为：病毒侵染后呼吸强度先上升，后下降。碳水化合物含量下降。淀粉在叶部积累引起黄化。多酚氧化酶和细胞色素氧化酶的活性增强，使植物细胞中毒坏死。光合作用下降，破坏了寄主的叶绿素。植物内源激素水平失去平衡，造成畸形。,第三节植物病毒病的症状特点,四.症状变化：一种病毒引起的症状可因病毒、寄主和环境三方面的因素而改变。1.病毒本身：病毒的株系(Strain)：同一种病毒在致病性上也有差异
13、，也称为病毒的生理小种，为了便于与真菌生理小种的区别，称为株系。有强株系(症状表现明显，危害较大)和弱株系(症状不太明显)。如：TMV(弱株系)番茄 花叶或斑驳 TMV番茄条斑株系(强株系)坏死，条斑 TMV弱株系侵染烟草引起轻微斑驳，强株系则引起严重花叶。,第三节植物病毒病的症状特点,交互保护作用(cross protection)：同一种病毒的弱株系先接种植物后，就可以保护寄主免受病毒强株系的严重伤害，即先侵染的病毒可以保护植物不再受亲缘关系较近的另一种病毒的侵染。如果两种病毒无亲缘关系则没有这种保护作用。,第三节植物病毒病的症状特点,拮抗作用和协生作用：拮抗作用：一种病毒侵染寄主植物后，
14、可抑制另一种病毒再对植物的侵染。如烟草蚀纹病毒可抑制天仙子花叶病毒和马铃薯病毒对烟草的侵染。协生作用：两种病毒侵染一种寄主植物后，可使症状比单独侵染时更为严重，加剧为害。如：番茄花叶病毒 轻微斑驳 番茄 坏死 马铃薯病毒 轻微斑驳,第三节植物病毒病的症状特点,2.寄主因素：一种病毒在不同寄主上可表现不同症状。如：TMV 普通烟全株型花叶症状 心叶烟局部性坏死枯斑潜伏侵染：一种病毒感染某些植物后，可以侵染但不表现症状的现象。如：小麦黄矮病毒在除小麦之外的禾本科作物上不表现症状。同一种病毒侵染同种寄主的不同品种上表现不同：a.抗病品种：产生局部枯斑反应。TMV心叶烟。b.高抗或免疫品种：病毒侵入后
15、增殖量很少或不能增殖。c.耐病品种：侵染寄主后可大量繁殖，但表现症状很轻微，这与真菌耐病性不同。,第三节植物病毒病的症状特点,3.环境因素：环境因素可抑制或改变症状的表现。（1）温度：35或10病害症状轻微，特别是对于花叶病，如油菜花叶病和TMV。隐症：已经表现病毒病症状的植株，由于环境条件改变，症状消失的现象。这种隐症在条件合适时又可重新表现症状。隐症：条件不同。潜伏侵染：寄主不同。（2）光照：过强、过弱都会影响症状的表现。多数在光弱时花叶病症状容易表现，接种易成功。,第四节 植物病毒的传播和移动,一、定义及一般特性 植物病毒从一植株转移或扩散到其它植物的过程称为传播，而从植物的一个局部到另
16、一局部的过程称为移动。根据自然传播方式的不同，可以分为介体传播和非介体传播两类。介体传播：是指病毒依附在其它生物体上，借它生物体的活动而进行的传播及侵染。包括动物介体和植物介体两类。非介体传播：在病毒传递中没有其它它机体介入的传播方式，包括汁液接触传播、嫁接传播和花粉传播。病毒随种子和无性繁殖材料传带而扩大分布的情况则是种非介体传播。传播实验是鉴定病毒的必要手段，因为要证实一种病害确由某种病毒引起或某种病毒确实存在，即证实侵染性，须使健株感染病毒，同时，了解病毒的传播规律也是病害防治的基础。,一、植物病毒的有效传播,近距离主要靠活体接触摩擦而传播，远距离则依靠寄主繁殖材料和传毒介体的传带。不少
17、病毒只有一种常规传播方式，但许多病毒则不止一种方式，而且任何一种均可能在流行中起重要作用，所以对传播方式的了解是植物病毒学的基础性工作。,二、介体传播,植物病毒的介体种类很多，主要有昆虫、螨类、线虫、真菌、菟丝子等。其中以昆虫最为重要。日前已知的昆虫介体约有400多种，其中约200种属于蚜虫类，130多种属于叶蝉类。在传毒介体中，昆虫是最主要的介体，其中70%为同翅日的蚜虫、叶蝉和飞虱，而又以蚜虫为最主要的介体，大部分昆虫传毒的资料来源于蚜虫传毒。,介体与所传病毒之间的关系,主要根据病毒是否在虫体内循环、是否增殖以及介体持毒时间长短来划分。病毒经口针、消化道进入血液循环后到达唾液腺，再经口针传
18、播的过程称为循回，这种病毒与介体的关系称为循回型关系(circulative)，其中的病毒叫做循回型病毒，介体叫做循回型介体。循回型相互关系中又根据病毒是否在介体内增殖而分为增殖型(propagative)和非增殖型(nonpropagative)。病毒不在介体体内循环的相互关系称为非循回型(nonc比ulative)。根据介体持毒时间的长短可以分为非持久性(nonpersistent)、半持久性(semipersistent)和持久性(persistent)三种相互关系。非循回型的关系全是非持久性的。而循回型关系中又进一步分为半持久性和持久性两种。,3介体与病毒专化性识别的可能机制,蚜虫的试
19、探(probe)取食习性：蚜虫对寄主或非寄主均有先从表面少量取食尝试的特性，如合适再刺入输导组织取食。在试探取食过程中即可完成对非持久性病毒的获毒或传播，所以能高效传播多种病毒，饥饿时促使试探频率增加故能提高传毒效率。介体内的专化性持毒位点：在介体消化道内有一定的持毒位点与所传病毒有专化关系。如某些非持久性、半持久性病毒在前消化道中有持毒点，因前消化道也随着昆虫蜕皮而更新，故蜕皮后不能传毒；蚜虫口针中的持毒位点已经得到免疫荧光标记的证明辅助因子(Helper component,简称HC)在蚜虫传播的非持久病毒的寄主细胞中，发现有一种由病毒编码的蛋白与传毒有关，如除去它，蚜虫也就失去传毒能力。
20、这种辅助因子也被称为蚜传因子，最早在马铃薯Y病毒侵染的植物中发现，但辅助因子的作用方式尚未明确。,(二)昆虫介体,1蚜虫 在蚜虫介体中，大约有200种蚜虫可传播160多种植物病毒，有的蚜虫只传播23种病毒，有的可以传播40一50种病毒(如蚕豆蚜和马铃薯蚜)，桃蚜甚至可以传播100种以上的病毒。在这160多种植物病毒中，有的只由一种蚜虫传播，有的可由多种蚜虫传播，黄瓜花叶病毒甚至可以由75种蚜虫传播。蚜虫传播植物病毒主要是非持久性关系,包括马铃营Y病毒属、花椰菜花叶病毒属、黄瓜花叶病毒属、苜蓿花叶病毒属等病毒。这些病毒也都很容易用汁液摩擦方法进行传播。非持久性病毒基本上是存在于薄壁细胞中，特别是
21、表皮细胞、表皮细胞和栅状组织细胞内，很少含在韧皮组织内。,2叶蝉和飞虱,在叶蝉(1eaf hopper)亚目(Cicadellidae)大约2000个属15000种叶蝉中，只有21个属中的49种是病毒的传播介体。飞虱虽然有20个科，但仅仅飞虱亚目(Delphacidae)中含有植物病毒介体。介体的寄主主要是禾本科植物，重要的作物病害如水稻矮缩病、小麦丛矮病和玉米粗缩病等。叶蝉和飞虱(Plant hopper)传播的绝大多数病毒属于增殖型，包括植物弹状病毒抖、植物呼肠孤病毒科、细小病毒属和玉米细条病毒属。叶蝉和飞虱传播植物病毒有相似的机制，它们不能传播非持久性的病毒，少数传播半持久性病毒，如水稻
22、东格鲁病毒。非增殖传播的病毒较少，主要是叶蝉传播的几种双联病毒。其它昆虫介体还有刺吸式口器的白粉虱、粉阶，刮吸式口器的蓟马、咀嚼式口器的甲虫、蚱蜢等等。,(三)土壤中的介体,病毒的土传是一种历史的提法，现已明确除了TMV可在土壤中存活较久外，土壤本身并不传毒，主要是土壤中的线虫或真菌传播病毒。已经知道5个属38个种的线虫传播80种植物病毒或其不同的株系，其中多数属于蠕传病毒属和烟草脆裂病毒属的病毒，少数为由于线虫在土壤中移动很慢，传播距离很有限，每年仅仅30一50cm。因此这些病毒的远距离传播主要依靠苗木其它球状病毒。其中大多数还可以通过感病野生杂草的带毒种子传播。传毒真菌主要是壶菌目和根肿菌
23、目真菌，其中油壶菌属(Olpidium)、多粘菌属(Polymyxa)、粉痂菌属(Spongospora)中的5个种能传播20多种病毒。,三、非介体传播,(一)机械传播 机械传播(Mechanical transmission)也称为汁液摩擦传播。田间的接触或室内的摩擦接种均可称为机械传播。田间主要为植株间接触、农事操作、农机具及修剪工具污染、人和动物活动等造成。机械传播对某些病毒很重要，如烟草花叶病毒属(Tobamovirus)和马铃薯X病毒属(Potexvirus)只有此种传播方式；如蠕传病毒属(Nepovirus)常经果树修剪传播；有些病毒在某些特殊种植条件下重要，如黄瓜花叶病毒(CMV
24、)在温室或大棚蔬菜、花卉中易接触传播。这类病毒的特点是病毒存在于表皮细胞、浓度高、稳定性强，引起花叶型症状的病毒或由蚜虫、线虫传播的病毒较易机械传播，而引起黄化型症状的病毒和存在于韧皮部的病毒难以或不能机械传播。,(二)无性繁殖材料和嫁接传播,由于病毒系统侵染的特点，在植物体内除生长点外各部位均可带毒，在以球茎、块根、接穗芽为繁殖的作物中特别重要，如马铃薯、大蒜、郁金香、苹果树等，如母株受侵染则无一幸免。这些无性繁殖材料都可以带毒，故成为重要的检疫对象。嫁接是园艺上非常普通的农事措施之一，也是证明疑难病原物侵染性的重要方法之一。嫁接可以传播任何种类的病毒、植物菌原体和类病毒病害。,(三)种子和
25、花粉传播,约15的病毒可以种传。种子带毒的危害主要表现在早期侵染和远距离传播。带毒种子随种子调运会远距离运输传播，是检疫的重要对象，如烟草环斑病毒(TRSV)、菜豆普通花叶病毒(BCMV)均可在豆科种子中存活5年以上。种子还可能成为病毒越冬的场所，如CMV可在多种杂草种子中越冬。种传病毒的寄主以豆科、葫芦科、菊科植物为多，而茄科植物却很少。病毒种传的主要特点是：母株早期受侵染，病毒才能侵染花器；病毒进入种胚才能产生带毒种子，而仅种皮或胚乳带毒常不能种传。种子带毒比例差别很大，如大麦条纹花叶病毒(BSMV)可达90一100%；黄瓜花叶病毒(CMV)可达1一50，一殷不会很高；种传病毒大多可以机械
26、传，症状常为花叶；如可蚜虫传则为非持久件的。随着种子的逐渐成熟，其种子带毒率逐渐降低；刚采收的种子带毒率高，经过贮存而逐渐降低。,四、病毒在植物体内的移动,植物病毒自身不具有主动转移的能力，病毒的移动都是被动的。病毒在细胞间的移动 胞间联丝是植物细胞间物质运输的通道。病毒的长距离移动 大部分植物病毒的长距离移动是通过植物的韧皮部(phloem)，而甲虫传播的病毒可以在木质部(xylem)移动。在植物输导组织中，病毒移动的主流方向是与营养主流方向一致的，也可以随营养进行上、下双向转移。TMV在叶片和植株内转移的过程，病毒接种在番茄中部复叶尖端的小叶的侧面，经过13天，病毒分布到整个小叶；经过35
27、天病毒则经过叶脉、叶柄及茎部的维管束系统到达根部和顶部；25天左右病毒已经在全株分布。,五、防治植物病毒病的基本原则,1.消灭和减少侵染来源(1)采用无毒种子和无性繁殖材料。(2)种苗处理，51-53温水中浸10分钟。(3)根尖或茎尖的组织脱毒培养。2.治虫防病，消灭传播介体。3.选育抗病或耐病品种。4.栽培管理减少人为传播发病，烟草打尖打杈时先打健株，再打病株。,第五节 植物病毒的分类与命名,植物病毒的分类工作由国际病毒分类委员会(Interrnational Committee on Taxonomy of viruses，ICTV)植物病毒分会负责。随着病毒学研究水平的提高，新的病毒属（
28、组）不断增加，尤其是病毒分类标准、指标内容越来越明确且接近病毒的本质。经过20多年的不断修改、充实，到1995年，ICTV先后发表病毒分类与命名报告六次，在第六次报告中，植物病毒与动物病毒和细菌病毒一样实现了按科、属、种分类。近代病毒分类体系趋于将病毒这类非细胞结构的分子寄生物列为独立的“病毒界”，下分为RNA病毒和DNA病毒两大类。但为方便及习惯，仍按寄主种类分为动物病毒、植物病毒、微生物病毒等实用系统分类。,一、植物病毒的分类,(一)分类依据 植物病毒分类依据的是病毒最基本、最重要的性质；构成病毒基因组的核酸类型(DNA或RNA)；核酸是单链(single strand,ss)还是双链(d
29、ouble strand,ds)；病毒粒体是否存在脂蛋白包膜；病毒形态；核酸分段状况(即多分体现象)等。根据上述主要特性，将植物病毒分在9个科47个属中（其中有些属、种尚未确定），各科(属)名称及其典型种见表43，各科(属)形态及核酸类型见图43,199。,病毒类似物,在病毒的研究过程中，还相继发现了一些与病毒相似、但个体更小、特性稍有差别的病毒类似物。要依赖其它病毒才能存在的小病毒或核酸，称为卫星(satellite)，它们依赖的病毒称为辅助病毒(heIper virus)。它们的核酸与辅助病毒很少有同源性，且影响辅助病毒的增殖；其中自身能编码衣壳蛋白的称为卫星病毒，不能编码衣壳蛋白的称为卫
30、星核酸。由于植物病毒的卫星核酸都是RNA，故称为卫星RNA(satellite RNA，sRNA)。一些无衣壳蛋白、RNA部分具有双链结构的称为类病毒(viroid)；含有线状和环状两种RNA的称为拟病毒(virusoid)；没有核酸只有蛋白质的侵染因子称为阮病毒(prion)。为了分类上的方便，将这些病毒都归入亚病毒(subviruses)，而由核蛋白体构成的病毒则称为真病毒(euviruses)。,(三)病毒的株系,株系(strain)是病毒种下的变种，具有生产上的重要性。当分离到一种病毒，但还未完全了解其特征、不能确定分类地位时，常称其为“分离物”或“分离株”(isolate)。,二、植
31、物病毒的命名,植物病毒的名称目前不采用拉丁文双名法，仍以寄主英文俗名加上症状来命名，如烟草花叶病毒为Tobacco mosaic virus，缩写为TMV；黄瓜花叶病毒为Cucumber mosaic virus，缩写为CMV。属名为专用国际名称，常由典型成员寄主名称(英文或拉丁文)缩写十主要特点描述(英文或拉丁文)缩写十virus拼组而成。如：黄瓜花叶病毒属的学名为Cucumovirus；烟草花叶病毒属为Tobamovirus。即植物病毒属的结尾是一virus，科、属名书写时应用斜体，而种和株系的书写不采用斜体。类病毒(viroid)在命名时遵循相似于病毒的规则，因缩写名易与病毒混淆，新命名
32、规则规定类病毒的缩写为Vd，如马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid)缩写为PSTVd。,第六节 植物病毒的鉴定原理,植物病毒的分类是将已知病毒按一定标淮、相似程度或相关性的顺序排列，拼成一个系统，即分类系统。植物病毒鉴定的主要目的是确定一种病毒在分类系统中的地位，由于植物病毒个体微小，结构简单，对寄主的依赖性强，鉴定工作难度大，技术性强，对工作条件的要求高。鉴定植物病毒过去大多采用病毒间生物学特性的差异，如所致症状类型、传播方式、寄主范围等；现在则增加了病毒核酸、蛋白分子生物学、生物化学等方面的方法。常用的方法有生物学实验、血清学检测和电子显微镜观察等。
33、,一、生物学实验,生物学实验的目的是确定病原的侵染性，用实验方法证明病毒与病害的直接相关性。生物学实验还可以确定病毒的传播方式，明确病毒所致病害的症状类型和寄主范围。在分子生物学技术尚欠发展的过去，只有生物学方法可以区分在遗传信息上一个核苷酸或者蛋白质中一个氨基酸的变异，因此生物学实验是其它实验方法所不可取代的。生物学实验中应用最多的是鉴别寄主，即用来鉴别病毒或其株系的具有特定反应的植物。凡是病毒侵染后能产生快而稳定、并具有特征性症状的植物都可作为鉴别寄主。组合使用的几种或一套鉴别寄主称为鉴别寄主谱。鉴别寄主谱中一般包括可系统侵柒的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主。如若区分经常出现的黄瓜花
34、叶病毒属的三个成员，采用表44的鉴别寄主。,二、电子显微镜技术,与光学显微镜相比，电子显微镜使用光源的波长更短(属于短波电子流)，因此分辨率也大大提高(9.9l 0-11m，比光学显微镜高千倍以上)。但是电子束的穿透力低，样品厚度必须在10100nm之间。所以电镜观察需要特殊的载网和支持膜，需要复杂的制样和切片过程。病毒观察最常用的是负染技术和免疫电镜技术。所谓负染，是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外围的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。与超薄切片(正染色)技术相比，负染不仅快速简易，而民分辨率高，目前广泛用于生物大分子、细菌、原生动物、亚细胞碎片、分离的细胞器、
35、蛋白晶体的观察及免疫学和细胞化学的研究工作中，尤其是病毒的快速鉴定及其结构研究所必不可少的一 项技术。,三、血清学技术,抗血清制备：利用植物病毒衣壳蛋白的抗原(antigen)特性，可以制备病毒特异性的抗血清(antiserum)。先将纯化的植物病毒注射小动物(兔子、小白鼠、鸡等)，一定时间后取血，获得抗血清。血清制备的关键是病毒的纯化，纯度高的病毒才能获得特异性强的抗血清。血清反应植物病毒与其血清的反应有好多种，但依据的原理都是抗原与抗体的特异性结合。最常用的两种方法是琼脂双扩散和酶联免疫吸附测定法。,琼脂双扩散法：在一定浓度的琼脂凝胶中，抗体和抗原互相扩散，在适当的位置形成沉淀；沉淀线的形
36、状说明抗原和抗体的相互关系。如图412：(1)说明两种抗原相同，都与已知的抗血清反应；(2)说明两种抗原有一定的亲缘关系，但不完全相同；(3)说明抗血清不专化，含有两种以上的抗体。酶联免疫吸附(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)法：该方法利用了酶的放大作用，使免疫检测的灵敏度大大提高。与其它检测方法相比较，ELISA有突出的优点：一是灵敏度高，检测浓度可达1-10ngm1;二是快速，结果可在几个小时内得到；三专化性强，重复性好；四是检测对象广，可用于粗汁液或提纯液，对完整的和降解的病毒粒体都可检测，一般不受抗原形态的影响；五是适用于处理大批样品，
37、所用基本仪器简单，试剂价格较低,且可较长期保存。具有自动化及试剂盒的发展潜力。ELISA是实现“快速、准确、经济”检测的最好手段之一图4l 3,四、核酸杂交及PCR技术,血清学技术利用的是病毒衣壳蛋白的抗原性，检测的目标是蛋白。由于核酸才是有侵染性的，仅仅检测到蛋白并不能肯定病毒有无生物活性。因此，核酸检测技术也是鉴定植物病毒的更可靠方法，主要有核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)方法比较常用。核酸杂交主要在DNA和RNA之间进行，依据是RNA与互补的DNA之间存在着碱基的互补关系。在一定的条件下，RNA-DNA形成异质双链的过程称为杂交。其中预先分离纯化或合成的已知核酸序列片段叫做杂交探针(P
38、robe)，由于大多数植物病毒的核酸是RNA，其探针为互补DNA(complementary DNA，cDNA)，也称为cDNA探针。核酸检测不仅可以检测到目标病毒的核酸，而且还可以检测出相近病毒(或核酸)间的同源程度。,聚合酶链式反应(PCR)是在短时间内大量扩增核酸的有效方法，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA 区段。从已知序列合成两段寡聚核苷酸作为反应的引物，它们分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补且位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，首先在过量的两种引物及4种dNTP参与下对模板DNA进行加热变性。随之将反应混合液冷却至某一温度使引物与其靶序列发生退火。此后退火引物在耐热的洲A聚
39、合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成这一循环。每完成一个循环，理论上就使目的DNA产物增加1倍，在正常反应条件下，经2530个循环扩增倍数可达百万。PCR扩增在检测标本中病原的核酸序列、由少量RNA生成cDNA文库、生成大量DNA以进行序列测定、突变的分析等方向已经得到广泛的应用。,五、物理化学等特性,在植物病毒研究的过程中，人们发现不同的病毒对外界条件的稳定性不同，这便成为区别不同病毒的依据之一。随着新病毒种类的发现和分子生物学研究的深入，人们也逐渐认识到这些物理特性在区分不同病毒中的局限性。1稀释限点(Dilution End Point，DEP)保持病毒侵染力的最高稀释
40、度，用10-1，10-2，10-3表示，它反映了病毒的体外稳定性和侵染能力，也象征着病毒浓度的高低。2钝化温度(Thermal Inactivation Point,TIP)处理十分钟使病毒丧失活性的最低温用摄氏温度表示。TIP最低的病毒是番茄斑萎病毒，只有有45；最高的是烟草花叶病毒，为97；而大多数植物病毒在5570之间；3体外存活期(Longevity in vitro，LIV)在室温(2022)下，病毒抽提液保持浸染力的最长时间。大多数病毒的存活期在数天到数月。,4 沉降系数及分子量 沉降系数S是指一种物质在20水中在1达因(1981g)的引力场中沉降的速度，单位是每秒若干厘米，因这一
41、单位太大，多采用其千分之一，即Svedberg单位。植物病毒的S20常在50S到数千S之间。沉降系数的测定要用超速分析离心机，根据该病毒在一定离心力下沉降的速度来计算。有了沉降系数还可以来计算分子量。5光谱吸收特性 由于蛋白质和核酸都能吸收紫外线，蛋白质的吸收高峰在280nm左右，核酸在260nm左右。因此260280的比值可以表示病毒核酸含量的多少，用于区分不同的病毒，比值小的多是线条病毒，比值高可能是球状病毒；对同一种纯化的病毒，紫外吸收值可以表示病毒的浓度，对未纯化的病毒其260280比值偏离标准值的情况，说明病毒的纯度.文献中常有E0.1%1cm260nm值,表示该病毒在01浓度，光径
42、为1cm比色杯中在260nm处的吸收值。6植物病毒的化学特性 主要是指核酸的类型、核酸的链数以及核酸的分子量、核酸在病毒粒体中的百分含量等。病毒核酸的这些特性用在病毒的分科、分属之中。,表4-4 黄瓜花叶病毒属三种病毒在鉴别寄主植物上的症状反应,鉴别寄主 黄瓜花叶病毒 花生矮化病毒 番茄不孕病毒 花生 无病症 褪绿，矮花叶 无症状 菊花 不侵染？侵染 黄瓜 花叶 花叶 无花叶,第六节 重要的植物病毒属及典型种,一、烟草花叶病毒属及TMV二、黄瓜花叶病毒和CMV三、马铃薯Y病毒属及PVY,一、烟草花叶病毒属及TMV,烟草花叶病毒属(Tobamovirus)具有13个种和2个可能种，典型种为烟草花
43、叶病毒(TMV)。病毒形态为直杆状，直径18nm，长300nm烟草花叶病毒属中大多数病毒的寄主范围较广，属于世界性分布；自然传播不需要介体生物，靠植株间的接触传播；对外界环境的抵抗力强。体外存活期一般在几个月以上。在干燥的叶片中可以存活50多年；稀释限点为l0-4一10-7，钝化温度90左右。引起的花叶病是烟草、番茄等作物上的重要病害，发生普遍严重。TMV主要靠病汁液接触传播，在农事操作中沾染了病株汁液的手或工具通过接触烟苗的微伤口侵入。由于病毒的抗逆力很强，混有病株残体的肥料、种子、土壤和带病的其它寄主植物及野生植物，甚至烤过的烟叶、烟末都可以成为病害的初侵染来源。,二、黄瓜花叶病毒和CMV
44、,黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)有3个成员，即黄瓜花叶病毒(CMV)、番茄不孕病毒(ToAV)和花生矮化病毒(PnSV)。典型种是黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)：粒体球状，直径28nm。CMV在自然界主要依赖多种蚜虫为传毒媒介，以非持久性方式传播，也可经汁液接触而机械传播，也有少数报道可由土壤带毒而传播。黄瓜花叶病毒的寄主十分广泛，天然寄主有67个科470种植物。病毒粒体的热钝化温度为55-70，稀释限点为 l0-3-l0-6，而存活期为 110d。传播CMV的介体昆虫主要是棉蚜和桃蚜，大约有75种蚜虫均能传毒。由于病毒体内的病毒含量很高，因此传播
45、效率很高。蚜虫传毒方式是口针型传毒非持久性。生产上通常采用冶蚜防病。栽种抗病或抗蚜品种，以及栽种屏障作物等限制蚜虫传毒的一些措施。,三、马铃薯Y病毒属及PVY,马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是植物病毒中最大的一个属，含有75个种和93个可能种。线状病毒通常长750nm，直径为1115nm。主要以蚜虫进行非持久性传播，绝大多数可以通过机械传播，个别可以种传。所有种均可在寄主细胞内产生典型的风轮状内含体，也有的产生核内含体或不定形内含体。大部分病毒的寄主范围局限于植物特定的科，如PVY限于茄科，MDMV(玉米矮花叶病毒)限于禾本科，大豆花叶病毒(SMV)限于豆科等；个别具有较广泛的寄主范围。
46、体外存活期24d，钝化温度50一65，稀释限点为10-2一l0-6(依株系而变)。该病毒主要浸染茄科作物如马铃蓄、番茄、烟草等，自然状态下，PVY以桃蚜等蚜虫以非持久方式传播。,第七节 植物类病毒,类病毒病害过去相当一段时间是作为病毒病来研究的，但由于始终不能看到病毒粒体，而不能确定病毒的归属。后来提纯得到核酸，证明了核酸的侵染性。最后确定为一类新的病原。,一、类病毒的发现和定义,类病毒的定义是：存在于植物中，分子量为1105u左右的、具有很高碱基配对的单链环状植物致病RNA，在健康寄主中不能检查到，它能在寄生主体内自主复制，并引起特殊的症状。类病毒(viroid)引起的病害症状主要有畸形、坏
47、死、变色等类型。典型病害是引起马铃薯纺锤块病(PSTVd)。类病毒对热以及对紫外光和离子辐射有高度的抗性，因为它的分子内含有互补的密集区域和以共价键结合成环状结构。目前已经发现了30多种类病毒，其中23种的核苷酸序列已经被分析出来。,二、类病毒不同于病毒的主要特性,1耐热性:要使类病毒失活需要高于100的温度。2高度侵染活性:50一100分子的类病毒可以引起成功的侵染，而病毒需要100万个粒体以上。3局限的存在部位:类病毒至今仅仅发现于细胞核中.4核酸组成的相近性:GC比相近，55一58；5不显性感染:植物带有类病毒但不表现症状的现象极为普遍。6传播方式简单:类病毒主要通过农具、嫁接刀具等传播
48、，大部分可以通过种于传播,有的可在种子中存活20年.,植物病毒参考书,1裘维蕃著，1984，植物病毒学（修订版），农业出版社 2复旦大学生物系译，植物病毒志（分集出版），上海科技出版社 3梁训生、谢联辉主编，1994，植物病毒学（全国高等农业院校教材），农业出版社 4Kurstak,E.1981,Handbook of Plant Virus Infections,Comparative Diagnosis.Elsevier/North-Holland Biomedical Press 5Matthews,REF.1992,Fundamentals of Plant Virology.Academic Press,
