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1、2022基于全基因组测序结核分枝杆菌宿主内异质性的鉴定及其研究进展(全文)摘要结核分枝杆菌(MyCObaCteriUmtubercu1.osis,MTB)作为引发结核病的主要病原体，其遗传多态性相对保守，随着二代全基因组测序技术的发展和普及，在不同宿主甚至同一宿主内都可观察到MTB菌株丰富的遗传异质性。宿主内异质性的成因包括不同菌株的多重C昆合)感染和同一菌株的微进化。宿主内异质性的发生机制及其对MTB耐药、传播和诊疗等方面的影响及应用尚未完全清楚。本文综述了MTB宿主内遗传异质性的鉴定及相关研究进展，以期为结核病防控工作提供更多新思路。传统观念认为，结核分枝杆菌(MyCObaCteriUmt
2、UberCII1.oSiS,MTB)是一种遗传同源且相对保守的细菌,其突变率低于大部分细菌，且基本上不存在水平基因转移事件。但研究发现,MTB在单一宿主内存在着显著菌群遗传多态性。这可能是由于多种不同基因型菌株的多重感染、外源再感染或同一基因型的菌株在宿主内微进化所致从而导致在同一宿主内观察到MTB菌群的异质性。MTB的宿主内异质性为结核病的传播、诊断及治疗带来重大挑战。笔者主要梳理了MTB遗传异质性的成因及鉴定方法，并对MTB异质性在临床上对患者耐药、治疗，以及从人群角度对传播推断等影响的研究进展进行综述。一、宿主内MTB异质性及多重感染的鉴定MTB多重感染也称混合感染或多克隆感染,是指同一
3、宿主感染遗传特征不相关的MTB菌株，导致其体内存在不同遗传类型的菌株(本文统一用多重感染指代这几类现象)。微进化是指宿主内单一遗传特征菌株在体内选择压力差异下所发生的遗传变异，从而在同一宿主体内同时观测到不同遗传变异的MTB亚群。一般认为因微进化所产生的可被衡量的遗传变异较小，而多重感染导致的则可能更显著。尽管如此，还是难以甄别一些复杂的感染情况，难以辨别所观测的遗传异质性到底是何种原因所致，因此，也将这些现象合称为复杂感染。多重感染是较早期被观察到的导致宿主内异质性的原因，可以通过临床样本中是否同时存在不同遗传特征(如基因型型别)的菌株来进行鉴定。早在1970年代，在噬菌体分型培养中发现了多
4、重感染现象，其后主要通过基因型分型方法进行判别。经典的基因型分型方法包括：间隔区寡核昔酸分型技术(SPo1.igotyPing)、IS6110限制性片段长度多态性(restrictionfragment1.engthpo1.ymorphism,RF1.P)分型和分枝杆菌散布重复单位可变数目串联重复(MIRU-VNTR)分型，这些方法都是针对MTB基因组特定或者规律性基因组元件来进行基因型分型，通过检测此类基因组中重复元件的拷贝数目和分布情况来评估体内是否存在不同的MTB菌株。这些方法对样本要求有所不同，IS6110RF1.P需要使用同一患者不同的样品进行检测，而M1.RU-VNTR等通常使用1
5、份样品即可鉴别。利用不同的分型方法，在不同地区的MTB多重感染比例不同，且基于这些单一类型基因组元件的分型方法分辨率有限，其准确度比较受限，即只有当复杂感染的菌株在上述基因组元件有差异，或存在的差异达到方法检测阈值时才能被识别。随着二代测序(next-generationsequencing,NGS)技术的发展，对MTB全基因组测序(Who1.e-genomesequencing,WGS)分析显示了其在耐药鉴定和演化、传播模式以及遗传多态性分析方面的高分辨率优势。由于NGS构建测序文库时通过对打散后的微小DNA片段进行扩增和高通量测序，理论上能记录下样本包含的MTB种群在基因组每个位点上的变异
6、情况(图IA),再通过生物信息学方法识别所需要的变异位点和频率等信息，为宿主内菌群异质性的特征研究提供了准确和高效的研究工具。近几年，基于测序数据，国内外学者研发了多个判别多重感染的生物信息工具或统计算法，其鉴别方法大致分为两类：一是通过对进化路径的判断，识别临床分离样本中是否存在不同进化路径(即代表不同基因型)的MTB菌株，如MiPORE(2022);二是通过分析样本中存在的单核甘酸多态性(sing1.enuc1.eotidepo1.ymorphism,SNP)位点分布频率异质性(如测序reads中突变频率小于30%,图1B),继而利用数理统计模型判断是否存在多重感染现象,如QuantTB(
7、2020).SPIitStrainS(2021)等工具,不过上述工具的应用价值还需要更多的现实多重感染样本的研究来进一步验证。除了不同的鉴定方法，检测样本的选择也会影响遗传异质性及多重感染的检出。如直接检测的临床生物样本比经再培养后检测的样本有更多的遗传多态性，肺切除术中组织的不同部位具有的MTB多样性也不一样，且相比于痰液培养样本具有更多的遗传异质性。所使用的培养基类型也可能会影响不同菌株的生长，从而影响检测多重感染的能力。此外，宿主的免疫能力水平也可能会影响多重感染的发生。在乌干达的一项研究发现，有至少50%感染HIV的晚期患者感染了多种不同型别的MTB但是HIV/MTB双重感染是否对多重
8、感染检出率的升高有影响还未有定论。随着WGS技术的普遍应用更多的结核病复杂感染被发现,除了多重感染,同一宿主内存在多态性不一的MTB菌株还可能是同一菌株在宿主内的微进化所致。因此，如何有效区分样本的异质性来源于多重感染还是因宿主内发生微进化导致的遗传多态性是研究的难点之一。其中，关键衡量指标包括出现多态性的基因组差异大小，如MIRu-VNTR差异位点数量，IS6110RF1.P的条带差异数以及基因组测序的遗传距离大小（表1）。以分辨率最高的NGS数据为例，已有的研究表明，同一宿主内一般存在相差100个SNP距离以上可认为是遗传特征不同的菌株，作为多重感染的判断依据；而相差不大于10个SNP可以
9、认为是同一菌群微进化导致。然而，对于10100个SNP之间的遗传差异判定,还未有定论。理论上，微进化和多重感染之间的判定应存在明显差异，即同一菌株不可能通过微进化演变为不同菌株的多重感染；但实际上有可能存在感染2种及以上遗传足够接近的不同菌株，从而造成这两种现象呈现出没有明显的遗传距离阈值界限的鉴别难题。表1釜定多感染及微进化方法口】方法分析对象结果识别况进化多/混合慧染参考文献噬i体分!19菌体Si落整解对特定结核分枝杆蠲遨OD体的易想性否对多个不同的结核分楂杆菌暧OB体且有易感性6-7/S6110PR制性片段长度势态性分型抬舞慢的插入序列限制性内切B1.带杀交指纹图诺12个个带差异2个条带
10、(24-25J1-3个个条差异3个条带26间隔区寡核甘酸分型直接重复区直接重复区序列奈交指纹图诺否多个基因里认定为混合感染27-28)结核分枝杆菌般在篁复单元可变数目串联整复序列特异性餐复序列基于PCR的拷贝数的差异1.5%(16S80个SNP80个SNP33140个SNP14GSNP|340-5个SNP757833个SNP35215个SNP否06)每个基因组0.5个SNP库否37生物信息软件/垸计法否不同进化路径等13/44MTJ注SNP:单核甘酸多态性新窗口打开|下藏CSV二、复杂感染和异质性耐药异质性耐药现象是指患者体内同时存在敏感菌和耐药菌，以及不同耐药谱的菌群共存。近年来，国内外越来
11、越多的报道鉴定了异质性耐药现象并揭示其可能的产生机制，包括本文论述的多重感染和微进化。宿主内的病原菌产生耐药相关的遗传变异是在药物等压力下的适应过程。随着NGS技术的发展，宿主内同一菌群发生的异质性耐药现象能得以观测到。比如单一时间点取样观测到敏感和耐药菌群共存，以及多个取样时间点观测到耐药相关突变此消彼长的动态过程。由于宿主内出现异质性耐药，从而导致表型与基因型耐药检测结果不符并且对治疗药物呈现不同的耐受程度。有研究表明，耐药位点的突变频率相比较其他功能位点的突变速率更高，可能是药物环境以及宿主体内不同病灶的空间异质性导致药物浓度差异加速了耐药位点的选择进程。一开始在体内发生耐药变化的菌株数
12、量处于劣势，其突变频率非常低，常规实验手段都很难捕捉这一现象，直到Zhang等使用PCR等技术对相关基因片段扩增,观测到了部分耐药位点存在异质性；SUn等利用二代WGS技术，利用异质性SNP率先描述了MTB宿主内耐药异质，性这一动态现象。除了微进化导致的异质性耐药，早期临床研究还发现宿主内发生耐药株和敏感株的多重感染，导致临床诊治呈现复杂现象，包括治疗过程中耐药表型的改变、疗程和结局改变等，这种复杂感染的情况可能与临床的不良结局相关。有学者提出多重感染引发的异质性耐药和临床不良治疗结局之间可能存在一定关系，但目前发表的研究对此有不同结论。Shin等对inhA启动子、katG基因和rpoB基因深
13、度靶向测序鉴定异质性耐药，发现多重感染与不良治疗结局相关，但是与异质性耐药无关。Chen等采用深度测序，发现新发结核病患者的分离株中均未发现频率05%的异质性耐药,在复治药物敏感结核病患者中出现0.5%1.%的异质性耐药，而这种低水平的异质性耐药与不良治疗结局之间没有相关性。因此，对于多重感染与不良治疗结局之间的关系是否与异质性耐药的产生有关仍需要进一步研究。发生多重感染的感染者体内还可能同时存在有不同耐药基因型的菌群。随着治疗的进行，体内的耐药谱会发生改变，产生的异质性耐药难以通过传统的方法进行检测或解释。此外，由于体内同时存在耐药菌和敏感菌，难以确保有效用药，使用二线抗结核药物可能会导致对
14、敏感菌株杀灭不彻底。多重感染导致的耐药异质性和耐药谱的变化也凸显了在临床治疗过程中进行耐药监测的必要性。为了检测早期出现的彳氐频的耐药相关基因突变，可以通过不断提高测序深度来提高低频SNP的发现率。有研究表明，如果需要得到1%频率的等位基因，在测序上至少提供400倍的片段覆盖率，不同的研究目的需要使用不同的测序深度。近几年还出现了深度靶向测序技术，相比于WGS,既可以节省成本加快检测速度，同时还具备对痰样本直接检测的能力，从而减少因培养导致的遗传多态性的失真，Deep1.exMyc-TB靶向深度测序可以直接对痰样本检测13种抗结核药物的耐药性，从而快速准确得到宿主内耐药谱以及异质性耐药的情况。
15、基于NGS甚至是三代测序开发的这些工具，有望进一步提高对异质性耐药的检测效果，具备指导临床精确治疗的应用价值。此外，在诊断应用方面，一项对同一MTB感染者的耐药变化的9年研究发现，使用二代WGS可以先于药物敏感性试验了解患者的耐药情况，使其在治疗上具有药物选择前瞻性。另外一项持续27年的研究发现，异质性耐药复杂情况会导致不良治疗结局，需要对耐药谱进行快速检验并据此制定有效的治疗方案。在治疗上，患者体内异质性呈动态变化并且有部分患者不断出现新的耐药相关变异，在一定程度上影响治疗效果。对于仅存在不同敏感菌株的多重感染对治疗结局影响的研究较少，这可能和宿主本身的特征（如免疫功能等）有关，目前还未有定
16、论。面对宿主内存在复杂的MTB亚群，会使得不同病灶对抗生素治疗产生不同反应。但是也有研究认为，异质性与疾病严重程度有关,但与治疗或耐药表型无关。因此，异质性耐药是疾病加重的表现，但对不良结局的影响还需要进一步研究。三、宿主内菌株异质性和传播MTB传播是基于人群的研究，主要目的是找到成簇的菌株，用来指代是否发生属于同一传播链的感染事件；而宿主内异质性变化主要针对个体研究。因此，如何同时观测群体与个体遗传多态性是主要挑战。相较而言，多重感染对传播的影响可能比较容易观察到，有研究曾在不太可能发生体内微进化的儿童感染群体中观察到多重感染，但是由于多重感染导致体内存在多个基因型，无法通过SNP阈值来鉴定
17、传播簇和传播关联，所以，大多数基于基因组测序数据的传播研究会舍去被认定为多重感染的菌株样本。多重感染的发生和人群的感染风险密切相关。对于一些人群聚集性较高且结核病传播风险较高的特殊场所，如监狱、医院等，更有可能检测到多重感染现象，甚至观测到涉及多重感染的传播事件。秘鲁的一项关于监狱结核病传播规律的研究发现，两种流行的耐多药菌株同时存在并且发生传播,使得该地频繁发生多重感染。近期一项在英国开展的长期基因组流行病学研究发现，该地区有至少9%以上的传播菌株可能发生了多重感染，且与传播事件明显相关联；并且这些多重感染相关的基因型在后续社区中被再次发现，为揭示多重感染促进结核病的传播提供了参考。多重感染
18、的风险和宿主易感程度以及人群中的感染风险压力呈比例，因此，在一般人群中，多重感染的高发可能代表当地的MTB传播较为严重，但能否作为当地传播发生风险的衡量指标有待进一步探索。大量关于MTB传播的研究是将基因分型技术与传统的流行病学调查结合作为研究手段，并依据SNP差值来量化遗传距离并结合流行病学调查来推断个体之间的传播方向。宿主内微进化所产生的遗传异质性会增加传播路径的推断难度。当前基于WGS技术推断传播的遗传距离值大多选择512个SNP,但是可能需要随着不同研究人群和研究目的而有所改变,尤其在传播过程中存在遗传异质性并不适用恒定的SNP阈值。遗传异质性还可以随着传播链直接传递。美国的一项研究发
19、现宿主内异质性可以直接传播给继发病例，这表明继发病例所感染的菌株已经累积了源病例体内的部分遗传异质性。但是微进化导致的异质性能够多大程度上在不同宿主间传播，以及这种传播是否遵循特定的模式，还需进一步研究。此外，传播促进了MTB整个种群遗传多样性的发展，传播过程中异质性涉及的基因是否存在选择偏好性,有待进一步研究。一项检测异质等位基因(heterogeneOUSa1.1.e1.es,hSNP)的研究发现，宿主间hSNP相似性与流行病学数据证实的传播之间具有一致性，表明检测hSNP可能增加了推断传播网络的分辨率。此外，基于基因测序数据构建的传播推断模型也将宿主内异质性纳入考虑，如TransPhyI
20、o传播推断软件包，在推断传播事件时考虑每个传播环节都在不同的个体宿主中进化,并模拟宿主内的遗传异质性在传播时丢失的情况，最终推断传播节点及判断是否存在未发现的继发病例。四、总结与展望多重感染和微进化导致的宿主内MTB异质性使得患者体内MTB的感染情况变得复杂，可能促进了耐药异质性的产生；同时，宿主内MTB异质性使得治疗过程中耐药诊断和治疗复杂化，还提高了传播规律研究的难度。目前，对于多重感染和异质性的研究还存在许多难点。例如，多重感染的准确鉴定以及在人群中的真实发生率有待准确估算；所导致的体内异质性又将如何影响传播研究的SNP阈值的确定；通过痰样本培养来获得临床菌株样本和药物敏感性试验，本身就导致遗传多样性的缺失，对准确鉴定耐药表型带来一定挑战。因此，在临床治疗上是否参考测序数据制定治疗方案会更加准确，值得进一步研究。最后，能否通过体内异质性变化来预测耐药发展趋势或者疾病疗程和效果也是一个值得关注的研究方向。未来还需要更多的研究来准确鉴定宿主内异质性的发生及其对流行传播规律研究和临床诊疗效果的影响，为结核病防控工作提供更多新思路。
