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1、2023单细胞组学在母胎界面研究领域的应用及进展(全文)摘要母胎界面在生殖成功中扮演关键角色，阐明妊娠早期母胎界面形成与演化机制，将为部分病理妊娠的病因研究及早期预测提供线索。目前，针对母胎界面的研究多在动物模型及体外细胞系进行，难以准确还原在体条件下细胞构成的关键特征。单细胞转录组测序能够在单个细胞水平揭示基因表达差异，有助于解析母胎界面细胞构成及其分化过程中的调控机制。但同时，单细胞转录组测序也存在一定的限制，如无法揭示基因表达上游调控、丢失细胞空间分布信息，以及易受细胞大小及组织解离效应影响。引入单细胞染色质可及性测序、空间转录组测序在内的单细胞多组学平台，可构建更加完整的母胎界面细胞图
2、谱及通讯网络，有助于对正常及病理妊娠的分子机制进行更加深入的研究。母胎界面主要由胎盘及蜕膜组成，在成功生殖中扮演着关键角色，其形成缺陷与多种病理妊娠密切相关。绒毛外滋养细胞(extravi1.1.oustrophob1.ast,EVT)是胎盘的重要组成部分，通过侵入蜕膜及子宫肌层,参与血管重铸，在胎盘形成与发育中发挥重要作用。EVT侵袭行为受内在表观遗传调控及外部母胎界面微环境的双重调节，阐明上述机制，将有助于揭示胎盘相关病理妊娠的发病机制，寻找可用于早期预测妊娠结局的生物标记，因此一直是生殖医学领域研究的热点与前沿。一、母胎界面与EVT妊娠早期，母胎界面的形成及演化过程被严格调控，以成功妊娠
3、。作为母胎界面的重要组成部分，胎盘承担着母胎物质交换、感染防御、激素合成及免疫耐受维持等多种功能，对胎儿正常发育和母体健康至关重要。人类与其他哺乳动物的胎盘存在显著差异，即EVT高度侵袭及子宫肌层深部浸润。EVT在构建母胎界面过程中扮演关键角色。EVT的侵袭行为在时空维度上被精确调节,受精后第15周,EVT穿越蜕膜到达子宫肌层内1/3,破坏子宫螺旋动脉管壁，参与血管重铸，最终形成高速低阻的母胎血液循环1,以保证胎盘灌注及胎儿生长发育的需要。EVT侵袭不足导致的胎盘形成缺陷是多种不良妊娠结局的病理基础,如子痫前期(pre-ec1.ampsia,PE胎儿生长受限、Stt(recurrentspon
4、taneousabortionfRSA)和死胎2o二、基因组印记与EVT侵袭行为的关系与体细胞相比，胎盘细胞具有独特且严格的表观遗传调控机制，其中基因组印记在滋养层分化与胎盘形成中发挥重要作用，印记紊乱与多种病理妊娠密切相关3o在孤雄受精来源的侵袭性葡萄胎(invasivehydatidiformmo1.e,IHM)中，滋养细胞过度增殖，母源印记基因呈现出低甲基化和高表达状态，例如P1.AG1.1.sGRBI0、MESTsKCNQ10T1.sSNRPN等，上述基因多参与细胞生长及基因表达调控等关键的生物学过程4-5O与此同时,一些研究在PE中观察到与IHM截然相反的印记紊乱，例如胚胎为父源印记
5、基因CDKN1.c杂合缺失时，妊娠小鼠表现出高血压、蛋白尿等类似PE的症状60在PE患者的胎盘中,父源印记基因H19杂合缺失导致其表达上调，与之相反,HI9表达下调被证实与IHM的发生及其高度侵袭行为有关7JO上述发现提示，基因组印记与EVT侵袭行为相关，但具体机制需要更加深入的表观遗传研究来解答。目前有关胎盘表观遗传调控的研究数据多来源于小鼠模型，但小鼠与人类胎盘的全基因组表达谱具有显著差异80此外，胎盘组织中母体血液和蜕膜细胞的污染可能导致母源等位基因假阳性表达。借助单细胞测序平台，可能在一定程度上解决上述问题。三、母胎界面微环境与EVT侵袭行为的关系蜕膜是母胎界面的另一个重要组成部分作为
6、胎儿-母体细胞通讯网络的中枢，在维持母胎界面微环境稳定中发挥关键作用。EVT通过与蜕膜细胞接触，从子宫内膜腺体获取营养支持，并与蜕膜间质细胞（deciduastroma1.ce1.1.1.DS巨噬细胞、自然杀伤（natura1.ki1.1.er,NK）细胞、动脉内皮细胞等相互作用，诱导上述细胞释放特定的细胞因子，调节自身的侵袭行为。子宫内膜间质细胞在蜕膜化过程中，通过分泌肝配蛋白B1.（EFNB1.胰岛素样生长因子KIGF1.）、肝细胞生长因子（HGF师穿膜蛋白KD1.K1.）等生长因子参与滋养细胞生长及分化同时表达CC型趋化因子配侬CC1.）2等多种免疫抑制因子，作用于母体免疫细胞，参与母胎
7、界面免疫耐受的建立及维持9o此外，蜕膜可能对EVT侵袭行为进行激活及抑制双向调节。临床上，胎盘植入常发生在蜕膜减少或缺乏的部位，如前次剖宫产术子宫瘢痕处或靠近子宫颈的子宫下段10,而在PE孕妇中，若干研究也发现了蜕膜化缺陷的存在,并与滋养层发育障碍及EVT侵袭能力下降相关11-120阐明母胎界面微环境在胎盘早期发育中的作用，特别是对EVT侵袭行为的调控机制，同样是生殖医学领域的研究热点之一。四、单细胞RNA测序在母胎界面中的研究尽管胎盘在生殖成功中发挥关键作用，但由于缺乏理想可靠的体内、体外模型，目前对人类胎盘早期发育，特别是EVT分化及侵袭行为调控机制的认识仍然有限13o此外，胎盘是由多种母
8、体、胎儿细胞组成的复杂系统，对胎盘进行组织水平RNA测序能在一定程度上了解胎盘发育的过程，但可能掩盖细胞异质性，并且容易引入母体混杂因素。单细胞RNA测序(sing1.ece1.1.RNA-seq,scRNA-seq)r又称单细胞转录组测序，能够在单个细胞水平揭示基因表达差异，保留细胞异质性信息，发现重要稀有细胞类型，有助于解析胎盘细胞构成及其分化过程中的调控机制14-16o1 .正常妊娠母胎界面的scRNA-seq研究：目前已有若干研究对正常妊娠中的胎盘及蜕膜进行了scRNA-seq在早中孕期蜕膜组织中，一方面发现了母胎界面中新的细胞类型,如母体蜕膜自然杀伤细胞亚群(deciduanatur
9、a1.ki1.1.erce1.1.1.dNK),通过激活杀伤细胞免疫球蛋白样受体-人类白细胞抗原系统参与EVT侵袭行为的双向调控17;另一面揭示了母胎界面微环境中部分细胞相互作用机制，如蜕膜树突状细胞1亚型刺激母体CD8+T淋巴细胞克隆扩张，但同时表达程序性细胞死亡蛋白1(PD-I)限制T淋巴细胞的活化程度;dNK1.细胞高表达SPINK2基因，dNK2和dNK3细胞高表达ANXA1.基因，上述两种基因编码抗炎因子17-18JO以上发现表明，母胎界面微环境可以抑制对妊娠有害的固有及获得性免疫反应，以及抑制EVT侵入和螺旋动脉重铸过程中引发的炎症反应。妊娠晚期,DS通过激活蛋白1信号通路参与子宫
10、平滑肌细胞唤醒，EVT通过激活蛋白1和白细胞介素inter1.eukinJ1.6信号通路参与分娩发动19o在绒毛膜羊膜中，母体巨噬细胞、NK细胞、T淋巴细胞以及EVT在I1.、核因子B(nuc1.earfactor-BzNF-B肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)等信号通路上出现功能富集；而在胎盘和底蜕膜中，成纤维细胞在爰帕琳肽(叩e1.in缩宫素信号通路中表现出功能富集；上述通路可能共同参与分娩发动。借助scRNA-seq对细胞来源进行准确鉴定后，可对孕妇外周血游离RNA(ce1.1.-freeRNA,cf-RNA)的动态变化进行检测：EVT、合体滋养细胞、胎盘间质
11、细胞来源的Cf-RNA随孕期进展增加，产后迅速清除，DS来源的Cf-RNA产后24h仍然存在，B淋巴细胞来源的Cf-RNA整个妊娠期间持续下降，T淋巴细胞来源Cf-RNA在妊娠中期下降、妊娠晚期升高，单核细胞、巨噬细胞、NK细胞来源的Cf-RNA随孕期进展增加，临产后，NK细胞及T淋巴细胞来源的Cf-RNA进一步升高20o2 .病理妊娠母胎界面的SCRNA-Seq研究：另有一些研究对病理妊娠中的母胎界面进行了scRNA-seq在排除胚胎染色体异常的RSA中，蜕膜细胞的构成与正常妊娠相似，但参与母胎界面组成的间质细胞(DS1.DS2)减少，而表达出血、衰老及凋亡相关因子的DS5比例增加，与此同时
12、，B细胞淋巴瘤-2蛋白（Bc1.-2）信号通路相关的细胞凋亡基因、信号素3A-神经纤毛蛋白1（SEMA3A-NRP1）信号通路基因（抑制新生血管形成）在所有DS细胞中广泛表达，提示潜在的蜕膜化缺陷可能导致胚胎植入时间窗提前关闭21o母胎界面免疫微环境紊乱可能在RSA发生中发挥重要作用，与正常妊娠相比，RSA蜕膜中多种免疫细胞炎症信号通路出现异常活化巨噬细胞上调Ce1.2、CC1.3、CC1.4、C型趋化因子配体NC1.2）和C-X-C型趋化因子配体（CXC1.）8等的表达，树突状细胞上调促炎因子CC1.1.9、CC1.22和细胞迁移因子肌动蛋白结合蛋白1（FSCN1.1溶酶体关联膜蛋白3（1.
13、AMP31Ras关联蛋白9A（RAB9A）的表达，肥大细胞高水平表达类胰蛋白酶B2（TPSB2GATA结合蛋白2、小眼畸形相关转录因子（MITF1.组氨酸脱竣酶（HDC）和跨膜结构域4亚家族成员A2（membrane-spanning4-domainssubfami1.yA2,MS4A2）等超敏因子，共同导致母胎界面的过度炎症反应。此外，NK细胞多种亚群（dNK1.、pNK和peri-NK/达高水平凋亡相关因子配侬FAS1.G）f与之对应，DS1.DS2和DS3中高表达Fas蛋白，巨噬细胞上调TNF超家族成员等细胞凋亡因子的表达，可能参与DS细胞凋亡22o在早产中，位于绒毛膜羊膜的母体巨噬细胞
14、NF-B表达显著上调，可能参与分娩过早发动。此外,早产母胎界面转录组特征在孕妇外周血Cf-RNA中同步呈现：与足月产相比，早产孕妇单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、T淋巴细胞来源Cf-RNA表达上调，可能作为早产的预测标志物200在PE孕妇的胎盘中,scRNA-seq发现EVT凋亡基因转录水平及转录异质性均升高，与之对应，EVT来源的Cf-RNA在PE孕妇中上调，表明EVT释放到母体循环中的Cf-RNA增加23o在母胎界面免疫微环境方面，PE孕妇蜕膜巨噬细胞CXC1.3和细胞间黏附分子1(ICAM1.)表达下调，继而干扰TNF信号通路和NF-KB信号通路，诱发EVT过度凋亡，同时通过激活NRP1
15、.通路抑制血管生成，可能在PE发生中发挥关键作用240如前所述，EVT在胎盘形成及母胎界面建立中扮演关键角色。目前已有若干针对妊娠早期母胎界面的scRNA-seq研究，主要通过拟时序分析重建特定细胞的分化轨迹，以及鉴定阶段性标志基因，包括一些新的细胞标记，如MFAP5基因可诱导细胞运动和癌细胞的侵袭，并与EVT侵袭和迁移相关9,18,25o对于涉及EVT分化过程中的基因表达调控，特别是基因组印记在EVT侵袭行为中的作用有待进一步阐明。五、单细胞多组学平台与空间转录组测序真核生物细胞核中染色质结构高度折叠，在基因转录时需要暴露目标DNA序列，供转录因子和其他调控元件结合，即为染色质可及性(chr
16、omatinaccessibi1.ity1利用转座酶研究染色质可及性的高通量测序(assayfortransposaseaccessib1.echromatinwithhigh-throughputsequencing,ATAC-seq)技术可对表观遗传调控机制进行研究。类似于scRNA-seq,单细胞ATAC-seq(sing1.ece1.1.ATAC-seqzscATAC-seq)能够在单细胞水平描绘基因转录的调控过程；并可对细胞进行逆向表征，发现新的细胞类型或细胞标志物。此外，通过比较等位基因亲本特异性ATAC的差异,可在转录上游验证基因组印记现象并探索其调控机制260scRNA-seq
17、可以绘制细胞转录图谱，但无法洞察与染色质可及性相关的上游调控景观；scATAC-seq因较高的背景噪声无法对细胞进行准确聚类和注释，并可能漏检稀有的细胞类型。借助单细胞多组学平台，对来自同一细胞核的可及性DNA片段和mRNA进行标记,能够获取同一细胞的RNA及ATAC数据，并对其基因表达图谱及表观遗传图谱进行整合及连锁分析，有助于深入研究基因表达调控机制，识别差异基因表达的驱动因素，特别是与疾病发生发展有关的关键调控因子，这些调控因子通常是潜在的诊断标志物和治疗靶点270单细胞测序技术能够在时间维度上解析细胞类型和基因表达模式，但难以还原细胞的原始空间位置信息，并且易受细胞大小及组织解离过程的
18、影响，特别是在胎盘中，大型合体滋养细胞在液滴封装过程中存在丢失的可能，需要免疫组化染色或荧光原位杂交实验获取组织切片中基因的空间表达信息，对单细胞测序数据进行验证，但上述技术一次仅能分析少数基因。空间转录组测序技术通过对组织切片中的RNA进行原位标记及全转录组测序，将携带空间分辨率的转录组数据与形态学特征相结合，使基因表达事件能够精确定位到组织的特定位置，从而获取不同功能区域的细胞构成及基因差异化表达信息，以及相邻细胞中受体-配体的共表达信息，对细胞图谱及细胞间相互作用进行补充和验证28-30o六、总结迄今为止，针对母胎界面的scRNA-seq研究已经分析了50余万个细胞,为深入理解正常妊娠中
19、母胎界面的细胞构成及通讯网络，以及阐明病理妊娠的潜在发生机制提供了参考。在设计母胎界面单细胞研究时，需要充分考虑研究对象间的异质性，包括时间、空间、个体间的差异，同时需符合伦理学原则，特别是在分娩前获取母胎界面标本存在一定的挑战。胎盘是RNA酶含量丰富的器官之一，如何正确处理离体样本，在减少RNA降解的同时，尽可能降低组织解离及批次效应对实验结果的影响，同样是研究者需要解决的问题。单细胞核RNA测序(sing1.e-nuc1.eiRNAsequencing,snRNA-seq)是一种可行的方案，snRNA-seq可用低温保存的冰冻组织直接制备单细胞核悬液，无需蛋白酶消化，从而减少了解离及批次效应的干扰31o从数据分析的角度出发，母胎界面包含母体及胎儿两种来源的细胞，如何准确鉴定细胞来源，是研究者无法回避的问题。此外，scRNA-seq仍停留在生物信息学层面，引入单细胞多组学平台、空间转录组学平台，对转录组数据进行验证，包括结合蛋白质组学、代谢组学、类器官等平台，以构建更加完整的母胎界面细胞图谱及通讯网络，有助于对正常及病理妊娠的分子机制进行更加深入的研究。
