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1、第三章蛋白质的分离纯化与表征,蛋白质的分离纯化与表征,蛋白质的酸碱性质蛋白质分子的大小与形状蛋白质胶体与沉淀蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的方法蛋白质含量测定与纯度鉴定,第三章 蛋白质的分离纯化与表征,蛋白质的酸碱性质,蛋白质中可解离的基团蛋白质的等电点,1蛋白质的酸碱性质,蛋白质中可解离的基团,-NH3+pKa=7.68.4,-COO-pKa=33.2,Next Page,1蛋白质的酸碱性质,蛋白质中可解离的基团,-COO-pKa=3.04.7,-COO-pKa=4.4,1蛋白质的酸碱性质,蛋白质中可解离的基团,pKa=5.67.0,-NH2pKa=9.410.6,1蛋白质的酸碱性质
2、,蛋白质中可解离的基团,pKa=11.612.6,pKa=9.810.4,pKa=9.110.8,1蛋白质的酸碱性质,蛋白质的等电点,蛋白质 等电点 蛋白质 等电点胃蛋白酶 1.0-胰凝乳蛋白酶 8.3卵清蛋白 4.6-胰凝乳蛋白酶原 9.1血清清蛋白 4.7 核糖核酸酶 9.5-乳球蛋白 5.2 细胞色素C 10.7胰岛素 5.3 溶菌酶 11.0血红蛋白 6.7,1蛋白质的酸碱性质,蛋白质分子的大小与形状,根据化学组成测相对分子量渗透压法测相对分子量扩散系数法测相对分子量沉降分析法测相对分子量凝胶过滤法测相对分子量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量,2蛋白质的分子形状与大小,根据化学
3、组成测相对分子量,肌红蛋白（Mb）M.W.=(Fe原子量)/(Mb中Fe含量)*100=55.8/0.335*100=16 700血红蛋白（Hb）一分子中含有4个Fe原子，因此：MW=4*16700=66 800,2蛋白质的分子形状与大小,渗透压法测相对分子量,=RT(+K*c2),c,Mr,c,=,RT,Mr,+K*c,c,c,Mr=,RT,lim,c0,c,Mr=10 000100 000,2蛋白质的分子形状与大小,扩散系数法测相对分子量,Fick第一扩散定律：扩散系数D求法（Fick第二扩散定律）,dm,dt,=-D*A*,dc,dx,dc,dt,=-D,d2c,dx2,c2,c1,=e
4、xp(-),x22-x12,4Dt,2蛋白质的分子形状与大小,扩散系数法测相对分子量,扩散系数D随蛋白质Mr的增加而降低。蛋白质 Mr 扩散系数（107cm2s-1)核糖核酸酶A 12 600 11.9细胞色素c 13 370 11.4肌红蛋白 16 900 11.3凝乳蛋白酶原 23 240 9.5血红蛋白 64 500 6.9过氧化氢酶 247 500 4.1肌球蛋白 524 800 1.1,2蛋白质的分子形状与大小,沉降分析法测相对分子量,蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。沉降速率与蛋白质分子的大小和密度有关，而且与分子形状、溶
5、液的密度和粘度有关。,2蛋白质的分子形状与大小,沉降分析法测相对分子量,斯维得贝格方程：,Mr=,RTs,D(1-),s为沉降系数:单位秒-1，通常将10-13秒 作为一个单位用S表示为偏微比容：蛋白质溶于水为0.74cm3/g为溶剂的密度,2蛋白质的分子形状与大小,2蛋白质的分子形状与大小,凝胶过滤法测相对分子量,洗脱液体积（mL）,蛋白质含量,相对分子量Mr,A,B,C,D,待测蛋白分子量,2蛋白质的分子形状与大小,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量,电泳时的迁移率取决于蛋白的净电荷、分子大小、形状；SDS（十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合，使全部呈负电荷，同时改变蛋白质单体分子构象成近
6、似球形；巯基乙醇打开二硫键，使亚基分离；电泳时蛋白质向正极移动。分连续和不连续体系（圆盘电泳）,2蛋白质的分子形状与大小,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量,2蛋白质的分子形状与大小,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量,A,B,Rf=A/B,2蛋白质的分子形状与大小,蛋白质胶体性质,胶体稳定性的三个要素：质点大小1100nm；带相同电荷；形成溶剂化层；稳定亲水性蛋白质胶体的因素：水化层：双电层：,3蛋白质的胶体性质,蛋白质的沉淀,盐析法：NaCl、(NH4)2SO4有机溶剂沉淀：乙醇、丙酮重金属盐沉淀：Hg2+、Ag+生物碱与某些酸类沉淀：单宁酸、TCA加热变性沉淀：,3蛋白质的胶
7、体性质,蛋白质分离纯化的一般原则,总目标：增加蛋白质含量与生物活性，除去不必要的杂质蛋白；前处理：细胞破碎粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机 溶剂沉淀等细分级分离：层析、电泳、结晶,4蛋白质的分离纯化,蛋白质的分离纯化方法,根据下列性质将蛋白分离纯化：分子大小溶解度电荷吸附性质对配体分子的亲和力,4蛋白质的分离纯化,透析与超过滤,4蛋白质的分离纯化,透析,通常是将浓缩液装在一个用赛咯吩（cellophane）制造的透析袋内，两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装有很多缓冲液的容器内进行透析。因为赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，仍然留在袋内，但蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进行交
8、换，通过多次更换透析液，就可除去小分子（如硫酸铵）。经硫酸铵分级纯化、透析的粗分级的蛋白质样品可以通过以下一些常用的分离纯化技术和方法进一步纯化和鉴定。,4蛋白质的分离纯化,超 滤,超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩，不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。超滤法是一种温和的、非变性的物理分离方法。,4蛋白质的分离纯化,超滤离心管,切向流超滤器,4蛋白质的分离纯化,离心技术,离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的
9、沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自的区带。常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。,4蛋白质的分离纯化,差速离心,Differential centrifugation as a first step in protein purification,4蛋白质的分离纯化,密度梯度（区带）离心,4蛋白质的分离纯化,密度梯度（区带）离心,4蛋白质的分离纯化,凝胶过滤,凝胶过滤层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定
10、相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。,4蛋白质的分离纯化,凝胶过滤（分子排阻层析）,基于分子大小,4蛋白质的分离纯化,利用溶解度差别的纯化,等电点沉淀（等电点时静电荷为零，相邻蛋白质分子间没有静电斥力而趋于聚集沉淀）盐析与盐溶（中性盐可以增加蛋白质的溶解度，称为盐溶；盐析作用主要是大量中性盐争夺蛋白质疏水
11、表面水分子）有机溶剂分级分离（有机溶剂降低蛋白质表面可解离基团的离子化程度，促进蛋白质的聚集和沉淀）,4蛋白质的分离纯化,利用溶解度差别的纯化,分级沉淀（盐或有机溶剂）,4蛋白质的分离纯化,利用电荷差别的纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦离子交换层析层析聚焦,4蛋白质的分离纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,平板电泳,4蛋白质的分离纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,管状电泳图谱,平板PAGE图谱,4蛋白质的分离纯化,等电聚焦电泳,蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正
12、极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。,4蛋白质的分离纯化,等电聚焦电泳,蛋白质在具有pH梯度的介质中电泳,4蛋白质的分离纯化,等电聚焦电泳,4蛋白质的分离纯化,二维电泳,1975年，OFarrell 首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白组工程的发展，
13、双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。二维电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。,4蛋白质的分离纯化,二维电泳,Isoelectric focusing is often combined with SDS-PAGE to generate two dimensional gels.,4蛋白质的分离纯化,二维电泳的应用示例,4蛋白质的分离纯化,离子交换层析,阳离子交换剂：CM-纤维素：-O-CH2COOH P-纤维素：磷酸基阴离子交换
14、剂：DEAE-纤维素：二乙基氨基乙基 AE-纤维素：氨基乙基,4蛋白质的分离纯化,离子交换层析,4蛋白质的分离纯化,4蛋白质的分离纯化,亲和层析,原理：依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合。配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体，也可以是受体、核酸、细胞器等。亲和层析是分离效率最高的分离方法。,4蛋白质的分离纯化,亲和层析过程示意图（1）,4蛋白质的分离纯化,亲和层析过程示意图（2）,4蛋白质的分离纯化,亲和层析过程示
15、意图（3）,4蛋白质的分离纯化,亲和层析过程示意图（4）,4蛋白质的分离纯化,4蛋白质的分离纯化,高效液相层析（HPLC）,高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography）与普通的色谱技术不同的是：填料密度高，洗脱液压力加大，分离效果更好。是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。,4蛋白质的分离纯化,高效液相层析（
16、HPLC）,高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。,4蛋白质的分离纯化,4蛋白质的分离纯化,高效液相层析（HPLC）,High Pressure Liquid Chromatography,High pressure limits diffusion and increases interactions with chromatograp
17、hy mediaHPLC gives very high resolution of protein components,4蛋白质的分离纯化,蛋白质纯化过程实例,4蛋白质的分离纯化,蛋白质的含量测定,凯氏定氮法双缩脲法Folin-酚法（Lowry法，蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色。）紫外吸收法Bradford法（考马斯亮蓝染料结合法）BCA法（bisinchoninic acid method）,5蛋白质的含量测定,凯氏定氮法,5蛋白质的含量测定,1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4,反应式
18、为：H2SO4=SO2+H2O+O R.CH.COOH+O=R.CO.COOH+NH3 NH3 R.CO.COOH+O=nCO2+mH2O 2NH3+H2SO4=(NH4)2SO4,2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于 H3BO3 溶液中。,反应式为:2NH4+OH-=NH3+H2O NH3+H3BO3=NH4+H2BO3-,3.再用已知浓度的HCL标准溶液滴定，根据HCL消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。,5蛋白质的含量测定,反应式为:(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO3,5蛋白质的含量测定,考马斯亮兰法（Br
19、adford法）,1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。,5蛋白质的含量测定,5蛋白质的含量测定,Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的
20、颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。,5蛋白质的含量测定,Bradford法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因
21、此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。,5蛋白质的含量测定,蛋白质的纯度鉴定,电泳（等电聚焦、SDS-PAGE、PAGE）沉降法HPLC溶解度分析N末端分析,6蛋白质的纯度鉴定,6蛋白质的纯度鉴定,附录 蛋白质组学研究（proteome）,知道了人类的全部遗传密码即基因组序列，就可以任意控制人的生老病死吗？,附录蛋白质组学,基因是遗传信息的源头，
22、而功能性蛋白是基因功能的执行体。基因组计划的实现固然为生物有机体全体基因序列的确定、为未来生命科学研究奠定了坚实的基础，但是它并不能提供认识各种生命活动直接的分子基础，其间必须研究生命活动的执行体-蛋白质这一重要环节。蛋白质组学（proteomics）研究即旨在解决这一问题。,附录蛋白质组学,附录蛋白质组学,蛋白质组学的研究内容包括：1.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。2.翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因
23、此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。,附录蛋白质组学,3.蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。,蛋白质组学研究方法,附录蛋白
24、质组学,二维电泳酵母双杂交系统：酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。,Schematic representations of library and matrix yeast two-hybr
25、id screens.(a)A model of the yeast two-hybrid system.The DNA-binding domain(BD)and transcriptional activation domain(AD)from a transcription factor are independently fused with candidate interacting proteins(the bait and prey,respectively).If the bait and prey proteins interact(curved line)within a
26、cell expressing both fusions,the resulting functional transcription factor can bind the promoter of a reporter gene and activate its transcription by interacting with the general transcription machinery(G).(b)A library yeast two-hybrid screen.A collection of preys are screened with a bait of interes
27、t by transforming yeast cells with plasmids encoding the constructs in order to isolate its interaction partners.(c)A matrix yeast two-hybrid screen used to generate a protein-protein interaction network.Several baits and preys are arrayed in 96-well microtiter plates and the fusion proteins are bro
28、ught together by mating.Diploids containing both bait and prey are isolated on selective plates and protein-protein interactions are ascertained by expression of the reporter gene.The dark squares indicate an interaction between the bait given at the end of the row and the prey indicated at the top
29、of the column.,抗体芯片：蛋白组学研究中一个主要的内容就是要研究在不同生理状态或病理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，它也是蛋白芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经用在研究的各个领域里。,附录蛋白质组学,附录蛋白质组学,质谱:(MALDI-Tissue-imaging)Analysis of a tissue slice of rat cerebellum.(a)The histological image(left)and the mass
30、spectrometry image(right)of a tissue slice.Lateral image resolution is 70 um.WM,white matter;GM,gray matter;GC,granule cells.Scale bar,1 mm.(b)The sum spectrum of all positions showed 700 individual peaks.Inset,higher resolution of the acquired spectrum.,http:/www.proteomeworks.bio-蛋白质组研究技术、信息等。http
31、:/从新药开发角度，发现新蛋白及新作用。http:/www.proteome.med.umich.edu 可以找到蛋白质组研究相关企业、各 种仪器来源、新闻等。http:/www.proteome.co.uk 各种蛋白质组研究相关信息 http:/www.micromass.co.uk 介绍蛋白质鉴定的先进仪器 http:/www.expasy.ch 蛋白质鉴定专家系统，Swiss Institute of Bioinformatics http:/expasy.proteome.org.au 蛋白质鉴定专家系统，Australian Proteome Analysis Facility http:/expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统，Canadian Bioinformatics Resours,附录蛋白质组学,
