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1、蛋白质分子基础,第二章:蛋白质的制备,本章主要内容,1.蛋白质分离纯化的一般程序2.蛋白质的粗分离 材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白质3.蛋白质的层析分离 原理,离子交换、凝胶过滤、亲和层析等4.蛋白质的电泳分析 原理、类型、聚丙烯酰胺电泳等,本章主要内容,5.蛋白质的结晶 原理、条件、方法6.提纯过程中的定量 双缩脲法、福林试剂法、紫外吸收法、考马斯亮蓝染色法7.蛋白质的纯度标准 电泳法、免疫化学法等8.蛋白质的大规模分离纯化 蛋白质来源及释放、分离和浓缩、大规模层析与电泳。,第一节 蛋白质分离纯化的一般程序,1.生物组织的机械破碎:研磨法、超声波法、冻融法和
2、酶解法等(细胞外分泌物无需破碎)。2.根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。3.离心:去亚细胞颗粒、细胞碎片等4.粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。5.精制：可用层析法、电泳法等进行精制。6.结晶：取得蛋白质晶体并测定蛋白质的性质。,蛋白质分离的注意事项,要建立一个方便灵敏的分析方法。要选择一种最好的含有目的蛋白质的材料分离步骤要尽可能少尽量避免蛋白质在提纯中的变性。低温（40C）、蛋白质酶抑制剂 巯基试剂（二硫苏糖醇）可防止半胱氨酸的氧化。金属螯合剂（EDT
3、A等）可防止重金属离子对酶的失活作用。,第二节 蛋白质的粗分离,材料的选择和细胞抽提液的制备蛋白质的浓缩和脱盐沉淀法分级蛋白质,(一)材料的选择,材料选择的原则目的蛋白质的含量要高容易获得不同种属和个体会有差别 动物：性别、年龄、季节、生理条件不同，蛋白质在质和量上会有区别 植物：不同组织、器官、不同发育阶段、有外来病理侵袭时各不相同。注意:取材后立即使用或置-10-50保存备用。,二、细胞破碎方法及细胞提取液的制备,破碎细胞的方法,温和方法较剧烈方法剧烈的方法,温和方法,细胞溶解 红细胞，渗透压破碎细胞膜酶降解 溶菌酶处理细菌，消化细胞壁化学溶解/自溶 甲苯抽提酵母，部分溶解细胞壁手动匀浆器
4、 肝组织，迫使细胞通过窄隙撕开细胞膜研磨 肌肉等，研磨产生的切割力破坏细胞,较剧烈方法,韦林氏捣切器（waring型）大多数动物组织和植物组织 切削作用和剪切力磨料研磨（砂、氧化铝）植物组织与细菌，微小粗糙表面破坏细胞壁,剧烈方法,压榨机（french press）迫使细胞在高压下通过小孔，剪切力破坏细胞 细菌和植物细胞超声作用 剪切力和空化作用破碎细胞 细胞悬浮液 震动玻璃球(直径0.51 mm)与玻璃珠一起快速震动，撕开细胞壁 细胞悬浮液研磨机 迫使细胞在高压下通过小孔，剪切力破坏细胞，大规模操作。作用于悬浮液,抽提缓冲液的提取,尽量使用类似于生理条件下的缓冲液，常用的缓冲液有：2050
5、mmol/L的磷酸缓冲液，pH7.07.5；0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.5；缓冲液中可加入EDTA（15 mmol/L）或者蛋白质稳定剂等。,其他注意事项,动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪。制备植物细胞时，在缓冲液中加入聚乙烯吡咯啉酮(PVP)可以减少褐变,它可以吸附多酚化合物。革兰氏阳性菌可用溶菌酶消化，370C处理15分钟即可溶解细胞壁。革兰氏阴性菌较难消化。可先用非离子去污剂（如Triton X-100）、巯基乙醇或甘油处理细胞。在溶液中还可加入脱氧核糖核酸酶I（10 ug/mL），可以使溶液的黏度降低，可以提高抽提液的质量。,三、膜蛋白的释放,膜蛋白存在于细
6、胞膜或各种细胞器当中(叶绿体、线粒体、内质网、或细胞核）外周蛋白 通过静电力或共价键和外膜脂质的极性头部螯合在一起。占膜蛋白的2030%内在蛋白（固有蛋白）嵌合在膜脂双层结构中。大部分膜蛋白是固有蛋白,生物膜的功能,生物膜研究的意义,外周蛋白,外周蛋白的分离,改变离子强度金属螯合剂（EDTA）可将其抽提出来,膜内在蛋白的提取,提取的原则 抽提膜蛋白时，首先削弱膜蛋白和膜脂的疏水结合，同时保持疏水基暴露在外的天然状态。此过程叫做增溶作用。常用的增溶剂是去污剂，它可以使膜蛋白疏水部分与膜分离，同时保留住膜蛋白表面的疏水结构。用去污剂增溶之后，膜蛋白要用透析的方法除掉去污剂，再进行其他方法的分离纯化
7、。,膜内在蛋白的提取,常用的去污剂 按结构可分为四种：1.阴离子去污剂：脱氧胆酸盐 2.阳离子去污剂 溴化十二烷基三甲铵 3.两性离子去污剂 二甲基十二烷基甘氨酸 4.非离子去污剂 Triton X-100,膜蛋白分离纯化胰岛素受体,从大鼠肝脏中分离胰岛素受体,释放膜蛋白的其他方法,用脂肪酶A消化脂肪，使膜蛋白释放出来。在高pH值和较高温度下进行超声作用，以释放膜蛋白。在低温(-200C)下，用丙酮处理组织和细菌，抽提出大部分脂肪。再将所得到的丙酮干粉溶在水溶性的缓冲液中，可溶性的蛋白就可以分离出来。再进行进一步的分离纯化。,蛋白质的浓缩与脱盐,蛋白质的脱盐,透析法:注:用前在含EDTA的溶液
8、中煮-除去核酸酶和蛋白酶纤维过滤透析法 中空纤维超滤膜分子筛层析法 Sephadex G-25,蛋白质的脱盐,蛋白质的浓缩,沉淀法：用盐析法或者有机溶剂法将蛋白质沉淀，再将沉淀溶于少量溶液中。吸附到离子交换柱上，然后用少量盐洗脱。干燥吸附法：用固体吸附剂如Sephadex G25等，冻干法，真空干燥法。渗透浓缩法：将干粉PEG-20000涂在装有蛋白质溶液的透析袋上，可吸干水分。超滤浓缩法：用超滤膜滤去小分子和水，达到超滤的目的。,在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。,超过滤法,加压,沉淀法分级蛋白质,蛋白质溶液,蛋白质分子表面带有亲水基团-具有水化作用，可以和水结合，
9、进入水溶液当中。在溶液的pH值偏离等电点时，蛋白质就会带同样的电荷，导致同性相排斥，使蛋白质分子进一步分散。等电点时整个蛋白质是中性的，水化作用此时最弱，蛋白质的溶解度值最小。,沉淀蛋白质的方法学,破坏蛋白质分子之间的水化作用。减弱蛋白质分子之间同性相排斥的作用。,沉淀蛋白质的常用方法,盐析法有机溶剂法有机聚合物沉淀法选择性变性沉淀法,盐析法,是一种向蛋白质溶液中加入浓的盐溶液使蛋白质变性的方法。盐溶：一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加。盐析:当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出。原因:将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很
10、强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出,导致蛋白质分子的沉淀。,盐析法,在高盐溶液中，蛋白质溶解度的对数和溶液中离子强度的关系:logS=logS0-KSI，I=sum(MZ2)/2S0为蛋白质在无盐溶液中的溶解度；S为蛋白质在某一离子强度溶液中的溶解度；I为中性盐的离子强度。Ks为盐析常数，与溶质的结构、盐的价数有关。M为溶液中各种离子的摩尔浓度，Z为各种离子的价数。,盐析法,(1)改变盐的I值(KS 分段盐析法):当盐种类确定后，在一定的pH和温度条件下，利用不同的蛋白质KS不同，改变盐的I值，可以分离不同的蛋白质。各种离子盐析能力的强弱如下：PO
11、43-SO42-C2O42-AC-Cl-NO3-;K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+(2)改变S0的值(分段盐析法):改变pH 和温度 达到等电点时,S0值最小 S0值随温度增加而降低-增加温度有利于蛋白质沉淀,盐析法,蛋白质浓度过高时，蛋白质分子之间容易发生共沉淀作用。因此，盐析时，蛋白质浓度不宜过高。最适的浓度通常在2.53.0%之间。盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法.,盐析法,硫酸铵盐析法 盐析能力强，在水中溶解度大：250C时为4.1 mol/L。不会引起蛋白质的变性。操作简便，可除去较多杂质。可浓缩蛋白质，有利于进一步纯化。价钱便宜。缺点
12、是分辨能力差，纯化倍数低。一定体积蛋白质加入饱和硫酸铵的体积数X：,有机溶剂法,在蛋白质溶液中加入有机溶剂，可以使蛋白质沉淀。原理：1.增大带电质点之间的静电力。2.破坏蛋白质表面的水合层，使蛋白质分子脱水而沉 淀。,有机溶剂法,选择有机溶剂的原则：1.必须能与水完全混溶；2.不与蛋白质发生反应；3.沉淀效应好；4.溶剂蒸汽无毒，不容易燃烧。常用的有机溶剂：丙酮 乙醇,有机聚合物沉淀法,作用原理与有机溶剂类似。常用的有机聚合物有：聚乙二醇(PEG);聚丙烯酸，可沉淀带正电蛋白质。,选择性变性沉淀法,适用于提取一些耐极端环境的蛋白质。用一些极端条件，使非目标蛋白质变性析出，从而将目的蛋白质纯化。主要方法有：热变性；pH变性(包括等电电变性)；有机溶剂变性。,适用于提取一些耐极端环境的蛋白质。用一些极端条件，使非目标蛋白质变性析出，从而将目的蛋白质纯化。主要方法有：热变性；pH变性(包括等电电变性)；有机溶剂变性。,掌握,蛋白质纯化的一般程序，说明重要的注意事项.膜蛋白破碎的主要方法.蛋白质浓缩和脱盐的常用方法.使蛋白质沉淀的主要方法及其原理(重点:盐析方法),
