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1、学习目的和要求熟悉DNA复制的一般规律，掌握DNA复制的特点；掌握真核生物和原核生物DNA复制的异同点；理解DNA复制的基本过程。,二、DNA的复制与调控,（教材P.37-51）,1、DNA复制的半保留性,全保留复制模型(conservative replication model）两条母链彼此结合，恢复原状，新合成的两条子链彼此互补结合形成一条新的双链。,（一）DNA复制概况,分散模型(dispersive model)亲代双链被切成双链片段，而这些片段又可作为新合成双链片段的模板，新、老双链片段又以某种方式聚集成“杂种链”,半保留复制模型(semiconservative replicat
2、ion model）DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的。,半保留复制的实验证据（Meselson 和 Stahl，1958）,复制叉与复制泡,从打开的起点向一个方向形成一个的叉形或Y形,从打开的起点向两个方向形成,复制开始时，双链打开,2、DNA复制的半不连续性,前导链,RNA引物,岗崎片段,随从链,原核：1000-2000bp真核：100-200bp,依DNA合成的起始方式，复制可分为从新起始与共价延伸两种类型。前者是前导链从新开始，也叫复制叉式复制；后者是先
3、导链共价结合在一条亲代链上，也叫滚环式复制。,（二）DNA复制的几种主要方式,1、复制叉式复制复制叉式复制是真核生物和原核生物中普遍存在的DNA复制方式。,滚环式复制是单向复制的特殊方式，是某些噬菌体DNA复制的共同方式。另外某些双链DNA的合成也通过滚环复制的方式进行。,2、滚环式复制,（1）滚环复制,（2）噜噗滚环复制（looped rolling circle replication）,（3）线粒体DNA的D-噜噗(displacement loop)复制,(4)型,DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段第一阶段为DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成；第
4、二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段；第三阶段为DNA复制的终止阶段。在DNA复制的整个过程中需要30多种酶及蛋白质分子参加,（三）DNA复制的过程,（1）DNA复制的起始点(origin of replication)：复制起始的特定DNA序列,复制起点的一般特征：1、它们都由多个独特的短重复序列组成；2、这些短重复序列被亚多基的复制起点结合蛋白所识别；它对于在复制起点组装复制酶具有关键作用；3、复制起点附近一般有一个富含A-T的序列，以利于双螺旋DNA解链或解旋，并产生单链DNA复制模板。,复制子或复制单元（replicon）：染色体上能
5、够进行独立复制的单位。细菌一个复制子，真核生物一条染色体上多个复制子。,1、DNA复制的起始阶段,定点开始双向复制 原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式,定点开始单向复制 质粒colE1,（2）DNA复制的方向,两点开始单向复制 腺病毒DNA的复制,解链酶(helicase),（3）DNA复制起始、引发体的形成及所参与的酶和蛋白质,DNA复制、修复、重组及接合过程，两条互补链必须部分分开形成单链DNA中间体-解旋-螺旋酶催化 发动蛋白，具有依赖DNA的ATPase活性，把ATP水解产生的自由能转化为解旋DNA并使螺旋酶本身沿DNA链移动的机械能 500-1000bp/秒 真核生物转录复合物
6、的组分，有些螺旋酶具有RNA螺旋酶活性,单链结合蛋白(single strand binding proteins,SSBP),又称为双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizing protein）由177个aa组成在E.coli 中以四聚体存在分子量为74KDa在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。A.SSB之间的相互作用；B.第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。,引发体的形成,A.引物酶(primase),B.引发体(primosome),（1）DNA的聚合反应和DNA聚合酶,2、DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子,DNA聚合酶的共同特点,第一，需要提供合
7、成模板；第二，不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3OH；第三，合成的方向都是5 3第四，除聚合DNA外还有其它功能,DNA聚合酶I,DNA pol是由一条多肽链组成，分子量为109KD。酶分子中含有一个Zn+，是聚合活性必须的。,DNA聚合酶有6个结合位点：模板结合位点；引物结合位点；引物3OH结合位点；底物dNTP结合位点；53外切酶结合位点；35校正位点。,DNA聚合酶的功能,A.53聚合活性,图 DNA聚合酶催化的DNA链延长,B.35外切活性,C.53外切活性 切口平移（nick translation）；链的置换；模板转换（template-switching）,缺刻平移标记DN
8、A探针,D.内切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段（E.coliDNA Pol Klenow fragment），又叫做Klenow聚合酶或Klenow大片段酶。它是由大肠杆菌DNA聚合酶全酶，经枯草杆菌蛋白酶（一种蛋白质分解酶）处理之后，产生出来的分子量为76KD的大片段分子。Klenow聚合酶仍具有5 3的聚合活性和3 5核酸外切酶活性，但失去了全酶的5 3的核酸外切酶活性。在DNA分子克隆中，Klenow聚合酶的主要用途有：（i）修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端；（ii）标记DNA片段的末端；（iii）cDNA克隆中的第二链cDNA的合成；（iv）DNA序列测定。,
9、Klenow片段,分子量120KD 100个酶分子/细胞 活性是DNA pol I的5%具有53聚合活性和35外切活性 没有53外切活性 与DNA修复有关,DNA聚合酶II,DNA复制过程中起主要作用的酶 由一个多亚基组成的蛋白分子,DNA聚合酶III,大肠杆菌DNA聚合酶特征,拓扑异构酶(topoisomerase)上一堂课已经介绍过。,(2)与超螺旋松驰有关的酶,表 大肠杆菌和真核生物中的拓扑异构酶,3、DNA复制的终止阶段,连接酶(ligase),连接酶的催化反应,复制终点（terminus）：决定复制终止的DNA片段。,其作用机制是分三步进行：EATPEAMPppi 在E.coli中，
10、ENADEAMPNMN（烟酰胺单核苷酸）E-AMP上的AMP转移到DNA的5-PO4上使其活化 活化的5PO4与相邻的3OH作用形成35磷酸二酯键，并释放出AMP。,E.coli的复制终止 现已发现有两个终止区域（terE,D,A和ter C,B），位于相遇点的另一侧100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。ter顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。终止需要tus(terminus utilization substance)基因的产物Tus(36kD)，Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。ter-Tus复合物可能通过
11、抑制螺旋酶来实行终止,1、与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点。,2、真核生物DNA复制的速度(60核苷酸/每秒钟)比原核生物DNA复制的速度(E.coli 1700核苷酸/每秒钟)慢,3、真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上的DNA的复制不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起始点可以连续开始新的DNA复制，表现为虽只有一个复制单元，但可有多个复制叉。,（四）真核生物DNA复制的特点,4、真核生物DNA的复制子被称为ARS（autonomously replicating sequences），长约150bp，包括数个复制起始必需的保守区。真核生物DNA复制的起始需
12、要起始原点识别复合物（ORC）参与。,5、在真核生物中主要有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶、和，其特性如下表。真核生物的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性,推测一定有另外的酶在DNA复制中起校对作用。,真核生物DNA聚合酶,6、端粒复制,端粒复制的生物学意义：（1）维持染色体的完成性，决定细胞的寿命；（2）维持染色体的独立性，若无端粒，两个染色体末端很可能融合到一起；（3）解决末端复制问题，端粒酶能与端粒作用，延伸其长度。,端粒酶催化端区TG链的合成,（五）DNA复制的忠实性和调控,1、DNA复制的忠实性（fidelity）,(二)DNA聚合酶的自我校正,(三)DNA聚合酶催化的反应
13、机制,(四)错配校正系统,问题:为什么在DNA复制起始要使用需要清除的RNA作为引物，而不使用可以不必清除的DNA为引物呢？,在DNA复制中，开始从头合成的引物（RNA或DNA）拷贝碱基容易错配，误差率至少为10-4；而且，开始阶段所形成的短核苷酸序列中的错配碱基也不易被校正。如果冈崎片段中的这些引物拷贝作为终产物保留下来，即使它们所占的比例只有5%，也会造成基因突变大大增加。因此，DNA复制中从头合成的引物最终必须除去，而用RNA引物要比DNA引物有利得多，因为RNA引物的核苷酸序列即使有错配最终也被清除，并由DNA聚合酶I合成的正确短DNA片段来填补。,（五）DNA复制的忠实性和调控,1、
14、DNA复制的忠实性（fidelity）,(一)RNA引物,为什么在DNA复制起始要使用需要清除的RNA作为引物，而不使用可以不必清除的DNA为引物呢？,(二)DNA聚合酶的自我校正,(三)DNA聚合酶催化的反应机制,(四)错配校正系统,起始被GATC半甲基化抑制(13min,1.5min)起始需复制起始点的Dam靶序列完全甲基化,2、DNA复制的调控,复制的调控发生在起始阶段，从复制原点起始一轮DNA复制，特异性蛋白因子对原点的识别和结合是关键的一步。当DNA复制起始以后，这种可为复制机构所利用的状态发生了改变，或者是DNA被修饰酶（如甲基化和去甲基化等），或者是特异性蛋白质因子被修饰（磷酸化
15、和去磷酸化等）。这样，使得在一个细胞周期中，复制原点通常只能被使用一次。总之，DNA复制是由活化物、阻遏物及它们的相互作用调节的。DNA复制的调控，包括DNA水平、RNA水平以及蛋白水平。,（1）大肠杆菌染色体DNA的复制调控,细胞内dnaA蛋白在起始时起关键作用，它的浓度决定了oriC质粒复制起始频率。半甲基化：oriC亲代链保持甲基化，新合成的链则未被甲基化 oriC和dnaA位点再甲基化的延迟,（2）ColE1质粒DNA的复制调控,（3）单链DNA噬菌体的复制调控,角噬菌体（X174、G4、S13）,丝状噬菌体（M13、fl、fd）,基因A在复制调控中起关键作用，编码两个蛋白A和A*，A
16、*蛋白仅有A蛋白的羧基端肽链,基因II和基因V产物,（4）真核细胞DNA的复制调控,真核细胞DNA 复制的3个调控水平,A.细胞周期水平调控B.染色体水平调控C.复制子水平调控,病毒SV40 DNA的复制调控,大T抗原,三个功能区：前期区、中心区和后期区,酵母染色体DNA的复制调控酵母复制起始受时序调控，也受因子和cdc基因调控。已克隆的ARS片段中都有14bp的核心序列，其中序列为A（或T）TT-TATPuTTA的11bp是高度保守的，这个区域的点突变使ARS失去复制起始功能。,DNA复制过程中的共同特征,（1）半保留复制；（2）形成复制叉结构；（3）半不连续复制；（4）复制起点具有特殊序列；（5）需要RNA引物；（6）复制的高度忠实性。,复习思考题,1、什么是半保留复制？什么是半不连续性复制？半保留复制有什么生物学意义？2、简述DNA复制的几种方式及其特点。3、简述DNA复制的过程及涉及到的关键的酶或蛋白质。4、原核生物DNA复制和真核生物DNA复制有何异同？5、简述端粒酶的作用机制及端粒复制的生物学意义。6、简述真核细胞DNA复制的三个调控水平。7、几个名词：复制叉、复制子、前导链和滞后链、冈崎片段、DNA聚合酶,
