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1、第二章DNA的复制、损伤与修复,DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。,DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就丰富了中心法则的内容。,DNA dependent DN
2、A polymeraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDRPRNA dependent RNA polymeraseRDRPRNA dependent DNA polymeraseRDDP,DNA复制的基本过程：复制的起始(initiation)DNA链的延伸(elongation)复制的终止(termination),第一节 DNA复制概况,一、DNA复制的半保留性 DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative rep
3、lication)。,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson 和 F.Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：,二、复制起点的结构特征DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。,3个连续的13bp序列，富含AT,反向重复出现四次9bp序列,酵母自主复制序列,在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。,三、RN
4、A引物 参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，通常为110个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,四、双向复制 DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。,五、DNA的半不连续复制由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为35。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链
5、的聚合方向为53，这一条链被称为前导链(leading strand)。而以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为滞后链(lagging strand)。,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，滞后链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由滞后链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。,半不连续复制 Semi-discontinuous replication 冈崎片段Okazaki fragment,L
6、eading strand,Lagging strand,Replication fork,前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的，因而称之为DNA的半不连续复制。,The short discontinuous segments are called Okazaki Fragments.In bacteria they are approximately 1000 nt in length;in eukaryotes they are approximately 200 nt in length.,图2-7 DNA双螺旋的解旋,第二节参与DNA复制的酶、相关蛋白及酶学机制,
7、在细胞中，双螺旋DNA复制是DNA聚合酶催化的酶促反应过程。但DNA聚合酶只能延长已有的DNA或RNA引物链，不能从头起始DNA链的合成；而且在DNA复制中形成特殊的复制叉（或生长叉）结构区内，DNA双螺旋中的两条链缠绕在一起，要拷贝每一条链都必须将双螺旋DNA解旋（unwinding），并释放或吸收由此产生的扭力，这就要求双螺旋和超螺旋的解,旋与重新形成，DNA聚合酶不能完成这一过程；在不连续合成中形成短的冈崎片段（Okazaki fragment）的连接也是DNA聚合酶无法完成的。实际上，在复制叉处进行复杂的DNA复制过程中，需要许多相关的酶和蛋白因子参与。主要有：DNA聚合酶；DNA解旋
8、酶；使DNA双股链在复制叉解开的解链酶；在DNA复制前防止解开的DNA单链局部退火的DNA结合蛋白；合成RNA引物的引发酶；,除去RNA引物的酶；使冈崎片段共价连接的DNA连接酶等重要的酶与蛋白因子。,一、DNA聚合酶与脱氧核糖核苷酸的聚合,（一）DNA聚合酶种类和生理功能：在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol）前三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是pol和pol。,pol为单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大
9、片段称为Klenow fragment，具有53聚合酶活性和35外切酶的活性。,pol 由十种亚基组成，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而亚基具有35外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。,DNA聚合酶和是在1999年才被发现的，它涉及DNA的错误倾向修复(errorprone repair)。当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶，使修复缺乏准确性（accuracy)，因而出现高突变率。高突变率虽会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活。,原核生物中的三种DNA聚合酶,在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为
10、DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol）。其中，参与染色体DNA复制的是pol（延长滞后链）和pol（延长前导链），参与线粒体DNA复制的是pol，pol与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，pol只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。,（二）DNA复制的保真性：为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：1遵守严格的碱基配对规律；2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3对复制过程中出现的错误及时进行校正。,二、DNA解旋酶与DNA超螺旋的松驰,天然DNA的负超螺旋虽然有利
11、于DNA的解旋，但随着复制的进行，复制叉前方亲代DNA中仍积累巨大的张力，因此复制中需要DNA解旋酶去除解链酶的解链产生的扭曲张力。大肠杆菌中的DNA解旋酶（gyrase）又称拓扑异构酶（topoisomerase），,由四个亚基组成四聚体22，而真核的呈二聚体。DNA解旋酶的作用机制如图所示。,Action of topoisomerase at the replication fork,Topoisomerase rapidly remove the positive supercoils accumulate in front of the replication fork.,DNA解旋
12、酶每作用一次产生两个负超螺旋，因此可以消除复制叉向前移动所产生的正超螺旋，并且复制完的两个子代DNA双链的分离也需要DNA解旋酶的催化功能。当加入DNA解旋酶的抑制剂如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixic acid）等时均能抑制细菌DNA的合成。可见DNA解旋酶是DNA复制所必不可少的。,DNA解旋酶对真核细胞有丝分裂也是非常重要，如果不解开缠绕，在任何细胞周期中姐妹染色体都将无法分离。此外，DNA解旋酶在转录、同源重组及可移动元件的转座中都起重要作用。,三、DNA解链酶和单链结合蛋白,复制过程中，复制叉在不断前进，复制叉前方的亲代
13、DNA就需不断解链，为使复制能够顺利进行，就必须防止DNA单链的链间或链内局部“退火”并保证其完整性与伸展性，使单链DNA处于稳定的状态。承担上述任务是DNA解链酶（DNA helicase）和单链DNA结合蛋白,（single-strand binding protein,SSB）。DNA解链酶是利用ATP水解获得的能量来打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称（又称解螺旋酶）。原核生物大肠杆菌为DnaB和Rep蛋白，DnaB结合于滞后链模板,DNA helicases separate the two strands of the double helix,DN
14、A双螺旋的解旋,沿53方向前进，Rep蛋白结合于前导链模板沿35方向移动（见图）。真核生物病毒中大T-抗原（T-antigen,T-ag）具解开双链的功能。此外也在一些真核生物中分离纯化出多种DNA解链酶，其功能还在鉴定证实中。,Binding of SSB to DNA inhibits the formation of intramolecular base pairs,DNA双螺旋的解旋,单链DNA结合蛋白（SSB）在细胞内行使很多涉及单链区域稳定性的功能（如同源重组）。在复制中，这包括稳定熔解起点，维持解旋酶活性，从DNA模板上去除二级结构以及抑制核酸酶活性。即SSB与DNA单链相结合
15、，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺利进行。在E.coli中SSB为,四聚体，对单链DNA有很高的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲合力。它们与DNA结合时有协同作用，即有一个SSB与DNA结合时，就会有更多的SSB迅速结合上去扩展分布整个DNA单链，将DNA包被上蛋白聚合体。SSB有某些碱基组成的倾向性，但很少有顺序专一性结合，可以周而复始地循环使用，在DNA的修复和重组中都有SSB的参与。,单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（single strand binding protein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这
16、是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,四、引发酶与引物RNA的合成,已经证明，DNA的半不连续复制中，DNA聚合酶不能从头起始新的DNA链合成，只能在已有引物的3端向前延伸。迄今为止，人们所发现的引物大多为一段RNA，其长度和序列随着基因组的种类而表现出不同，在大多数情况下为110个核苷酸（表2-3）。,表5-3 DNA复制中滞后链前体片断的RNA引物,催化RNA引物（RNA primer）合成的酶叫引发酶（primerase）。引发酶识别DNA单链模板特异顺
17、序，以核糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸产生3-OH，为DNA聚合酶起始生成磷酸二酯键提供条件。引物与典型的RNA（如mRNA）不同，它们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。E.coli的引发酶是一条肽链，分子量为60 000，每个细胞中有50100个分子，,它是由大肠杆菌dnaG基因所编码的。该酶单独存在时是相当不活泼的，只有在与有关蛋白质相互结合成为一个复合体时才有活性。这种复合体就称为引发体。机体选择RNA作为引物，其原因可能在于减少致死突变（lethal mutation）。DNA复制中，从模板拷贝最初的几个核苷酸时，由于碱基堆集力很弱，其氢键结合能力也很弱，因而碱基对的错
18、配几率就大很多，加上这几个核苷酸,还没有与模板形成稳定的双链结构，DNA聚合酶35校对功能很难发挥作用。因此为了保证生物DNA复制的保真度，采用以RNA为引物这种过渡形式，既为DNA聚合酶提供3-羟基端，又容易被 DNA聚合酶识别而停止其聚合作用，且便于DNA聚合酶进行切口平移。切口平移过程中发生错误的几率极少，因为DNA聚合酶（pol I）有35外切核酸酶活性，具有校对功能。,五、DNA连接酶,DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。,DNA连接酶催化的条件是：需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；未封闭
19、的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,第三节 DNA复制的几种主要方式,DNA复制通常是从双螺旋的特定位置复制原点（ori）开始，一般是富含A-T的区段，该区段的双链DNA具有较强的呼吸作用（breathing），是经常瞬间处于打开形成单链的区段（frequently opening region），由此产生的瞬时单链与SSB蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）结合，对复制的起始十分重要。,原核生物的复制原点通常为一个，而真核生物则有多个特定的复制原点。,图2-17
20、 DNA复制的不同方式,依DNA合成的起始方式，复制可分为从新起始与共价延伸两种类型：一、复制叉式复制 二、环状DNA双链的复制,一、复制叉式复制,(一)、复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。1、预引发：（1）解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA,结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。对于双向复制而言，形成的两个复制叉向相反方向行进，每个复制叉上的两条DNA链均被拷贝。,图5-12 复制叉（箭头表示子链总的生
21、长方向）,（2）引发体组装：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。,2、引发：在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。（二）、复制的延长 1、聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以35方向的亲代,DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中，是DNA聚合酶(延长滞后链)和（延长前导链）。,2、引发体移动：引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，滞后链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。,（三）、复制的终止 1、去除引
22、物，填补缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。,2、连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,二、环状DNA双链的复制,(1)型(2)滚环型(rolling circle)(3)D-环型(D-loop),大肠杆菌质粒DNA双向复制的模式与实验验证。左：形复制模式图；右：3H标记质粒DNA合成图。,（一）环状DNA双链的型复制,（二）、滚环式复制：环状DNA
23、可以通过这种方式产生多单元单链DNA,双链环状DNA,复制起始于某一条DNA链上,新生DNA链延伸，不断取代母链,复制一圈，产生单位长度的线性DNA链,若复制继续进行，可产生多单元线性DNA链,单向复制的特殊方式X174的双链DNA复制型(RF),滚环式复制,首先在动物线粒体中被发现。一条短RNA与一条DNA互补，取代了该区域原来的互补的DNA链，使得两条链的合成高度不对称，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则为游离的单环。,（三）D loops单向复制的特殊方式,双链环状DNA中的一条前导链已经引发并开始合成，与其模板形成双链结构，而另一条亲本链则被前导链置换出来成为单链状态。这种由一条单链
24、和一条双链组成的三元泡状结构，叫做置换噜噗或D-噜噗（displacement loop）。只有前导链将另一条亲本链（即滞后链的模板）的特别序列置换出来成为单链形式，才能产生滞后链前体的引发并合成其互补链。线粒体DNA的复制就是以这种有趣的不对称方式进行复制，并由真核DNA聚合酶负责。,三、真核生物DNA的复制特点,(一）、真核生物有多处复制起始点。（二）、真核生物复制子相对较小，为40-100千碱基对。在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始。DNA复制只在S期进行。,真核生物DNA的复制子被称为ARS(autonomously replicating sequences)，长
25、约150bp左右，包括数个复制起始必需的保守区。,真核生物DNA复制的起始需要起始点识别复合物（origin recognition complex，ORC）参与，ORC结合于ARS，它是由6种蛋白质组成的启动复合物。,（三）、真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50bp/秒，还不到大肠杆菌的1/20。因此，人类DNA中每隔30,000-300,000bp就有一个复制起始位点。,（四）、DNA聚合酶 真核生物DNA聚合酶有15种以上，在哺乳动物细胞中主要有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶、和。,真核生物DNA聚合酶的特性比较,DNA聚合酶主要参与引物合成。,DNA聚合酶活性水平稳定，主
26、要在DNA损伤的修复中起作用。,DNA聚合酶主要负责DNA的复制。,DNA聚合酶与后随链合成有关，在DNA合成过程中核苷切除以及碱基的切除修复中起着重要的作用。,DNA聚合酶在线粒体DNA的复制中发挥作用。,真核生物中还存在、和等几种DNA聚合酶，它们承担着修复损伤的功能，但这些修复酶的忠实性都很低。,（五）真核生物端粒和端粒酶：端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）
27、的催化下，进行延长反应。端粒酶是一种参与真核生物染色体末端的端粒DNA复制的RNA-蛋白质复合体，其本质是一种逆转录酶，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒酶(telomerase)的作用机制,被延长的TG链可以作为合成冈崎片段的模板，使端粒形成双链。,端粒酶以自身的RNA作为端粒DNA复制的模版，合成出富含脱氧单磷酸鸟苷Deoxyguanosine Monophosphate(dGMP)的DNA序列后添加到染色体的末端并与端粒蛋白质结合，从而稳定了染色体的结构。细胞发生癌变后，端粒酶活性比正常时明显增高，端粒DNA这种渐进性缩短趋势受到阻碍，使正常细胞转化成具有
28、无限分裂能力的永生化恶性细胞。端粒酶的活性是癌细胞的一种标志，可以作为癌症治疗中的一个靶子。,第四节 DNA损伤与修复,作为一种能决定生命状态存在和延续的生物大分子，DNA在遗传过程中必需保持高度的精确性和完整性，而且这种性能是细胞中任何一种分子都无法与之相比的。尽管如此，在DNA复制过程中，仍难免会存在少量未被校正的差错。此外，DNA还会受到各种物理和化学因素的损伤。这些差错和损伤如果不被修复，将会,产生严重的细胞学后果，因为DNA分子本身是无法替代的，一个细胞通常只有1-2套基因组DNA，而不像蛋白质和RNA分子那样，能利用DNA中的遗传信息不断产生新的分子来替代受损伤的分子。所以，维护D
29、NA遗传信息的稳定性对生物细胞来说是极其重要的。在漫长的生命进化过程中，生物体不仅演化出能纠正,复制错误的“校正”系统，而且在细胞中形成了多种多样的DNA修复系统，能对各种DNA的损伤进行修复，恢复DNA正常的超螺旋结构，以保持每个世代遗传信息的稳定性。极少数不能修复的DNA损伤将会导致基因的突变，其中一部分突变将有利于物种的进化，而另一部分突变将导致细胞发生变异和死亡。,一、DNA的损伤,由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。,（一）引起DNA损伤的因素：1自发因素：1)脱嘌呤和脱嘧啶 在生理
30、条件下，DNA分子通过自发水解经常发生脱嘧啶和脱嘌呤反应，使嘌呤碱和嘧啶碱从DNA分子的脱氧核糖-磷酸骨架上脱落下来。Lindahl估计，一个哺乳动物细胞在37条件下，20小时内通过自发水解可从DNA链上脱落约10000个嘌呤碱和500个嘧啶碱。,2）碱基的脱氨基作用 碱基中的胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）都含有环外氨基，氨基有时会自发脱落，从而使胞嘧啶变为尿嘧啶（U），腺嘌呤变为次黄嘌呤（I）,鸟嘌呤变为黄嘌呤（X）。例如，胞嘧啶自发水解脱氨变成尿嘧啶后，如果未被修复，产生的尿嘧啶会在接下来的复制中与腺嘌呤配对，从而产生点突变。,3）碱基的互变异构 DNA中的四个碱基都可能自发地使
31、氢原子改变位置而产生互变异构体，从而使碱基的配对形式发生改变。如腺嘌呤的稀有互变异构体与胞嘧啶配对，胸腺嘧啶的稀有互变异构体与鸟嘌呤配对。当DNA复制时，如果模板链上存在着这样形式的互变异构体，在子链上就可以产生错误，造成DNA损伤。,4）细胞正常代谢产物对DNA的损伤 在所有需氧细胞中，细胞呼吸作用产生的副产物超氧阴离子（O2-）和H2O2非常活跃，由于这些超氧化物、羟基自由基（OH）等活性氧的存在，导致DNA在正常条件下发生氧化损伤。,2物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC
32、等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,3化学因素：(1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。,(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。(3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。(4)碱基类似物：如5-FU，6-MP等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。(5)断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。,二、DNA损伤的修复,生物体内存在多种修复途径：光复活修复系统切除修复系统重组修复系统错
33、配修复系统SOS修复系统等。DNA分子的双螺旋结构是其损伤修复的重要基础，因为DNA的互补双链可保证其一股链上的损伤被切除后，能从另一股链上获得修复所需要的信息。,（一）光复活修复（直接修复）（light repairing）：这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程为：光复活酶（photo-lyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物在300600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复光复活酶从DNA上解离。,（二）切除修复(excision repairing)：切除修复（excision repair）需要先识别损伤部位，
34、然后切除损伤的碱基或核苷酸，用正常的碱基或核苷酸填补缺口，用连接酶连接切口。1、碱基切除修复 碱基切除修复（base excision repair,BER）是在DNA聚合酶、DNA糖苷酶、内切酶和连接酶等参与下完成的。DNA糖苷酶（DNA-glycosylase）可以特异性识别并将不正常的碱基水解切除，形成无碱基的AP位点（AP site），由AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开，然后外切酶切除包括AP位点在内的DNA链，聚合酶填补单链缺口，最后由连接酶将链连接。BER特别适合于修复较轻的碱基损伤。,碱基切除修复,2、核苷酸切除修复 核苷酸切除修复（nucleotide excisio
35、n repair,NER）主要用来修复导致DNA结构发生扭曲并影响到DNA复制的损伤，如可造成DNA发生大约30o弯曲的嘧啶二聚体。主要由5步反应组成：由特殊的蛋白质探测损伤，并引发一系列蛋白质与损伤部位的有序结合。由特殊的内切酶在损伤部位的两侧切开DNA链。去除2个切口之间的带有损伤的DNA片段，形成缺口。由DNA pol填补缺口。由DNA连接酶连接切口。,（三）重组修复(recombination repairing)：其过程分为三个步骤：1、复制，损伤的DNA仍然可以复制，但复制到损伤部位时，子链就出现了缺口。2、重组，从完整的母链将相应的片段移到缺口，而母链上形成缺口。3、填补和连接，
36、母链上的缺口由DNA聚合酶进行填补合成，最后由DNA连接酶连接。,重组修复是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。修复过程中，DNA损伤并未除去，但随着复制的不断进行，损伤部位被逐渐稀释，实际上消除了损伤的影响。,（四）、错配修复DNA复制是一个高保真过程，但其正确性毕竟不是绝对的，复制产物中仍会存在少数未被校出的错配碱基。通过对错配碱基的修复将使复制的精确性提高102-103倍。现已在大肠杆菌、酵母和哺乳动物中都发现了错配修复系统。复制,错配中的错配碱基存在于新合成的子代链中，错配修复是按模板的遗传信息来修复错配碱基的。因此，该修复系统必须有一种能在复制叉通过之后识别模板链与新合成
37、 DNA链的机制，以保证只从新合成的DNA链中去除错配碱基。在大肠杆菌中主要通过对模板链的甲基化来区分新合成的DNA链。大肠杆菌中存在一种Dam甲基化酶，它通常首先对DNA模板链,的5-GATC序列中腺嘌呤的N6位置进行甲基化，当复制完成后，在短暂的时间内（几秒或几分钟），只有模板链是甲基化的，而新合成的链是非甲基化的。正是子代DNA链中的这种暂时半甲基化，可以作为一种链的识别标志，以区别模板链和新合成的链，从而使存在于GATC序列附近的复制错配将按亲代链为模板进行修复。几分钟后新合成链也将在Dam,甲基化酶作用下被甲基化，从而成为全甲基化DNA。一旦两条链都被甲基化，这种错配修复过程几乎不再
38、发生。由于甲基化DNA成为识别模板链和新合成链的基础，且错配修复发生在GATC的邻近处，故这种修复也称为甲基指导的错配修复（methyl-directed mismatch repair）。,（五）SOS修复：这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。,三、基因突变,突变是在DNA分子碱基序列水平上所发生的一种永
39、久性、可遗传的变化，它是与遗传保守性相对立而又相互统一的自然现象。生物进化始于基因突变（mutation），并通过基因突变的积累和遗传导致生物种属的演化。,（一）、基因突变的类型碱基序列发生改变的基因我们称之为突变基因（mutant gene）。携带突变基因的生物个体或群体或株系通常称为突变体（mutant）。基因没有发生变化而表现正常的生物个体则称为野生型（wild type）。突变及其在机体中的后效也可用基因型（genetype）和表现型（phenotype）两个术语来表述，前者,用于描述突变及其所处基因；后者用于描述突变在机体中的后果。此外，按照突变生成的过程可将突变分为自发突变（spo
40、ntaneous mutation）和诱发突变（induced mutation，简称诱变）两种类型。由于自然界中突变剂的作用或由于偶然的复制错误而产生的突变都属于自发突变。由于人们使用突变剂处理生物体而产生突变则是诱变。从不同角度,看，基因突变可以分为许多相互联系的类别。目前人们最了解和最常见的基因突变主要有以下两类：1、碱基置换突变指基因中一个或少数几个碱基被替代的突变。最简单的碱基置换突变是点突变，即DNA序列上单个碱基的改变。如前述镰刀型红细胞贫血病人的血红蛋白中，链第6为谷氨酸被缬氨酸取代，其编码链,DNA序列中的谷氨酸密码子GAG被置换为缬氨酸密码子GTG，两者之间仅发生了一个碱基
41、的改变。点突变如果是嘌呤与嘌呤之间，嘧啶与嘧啶之间发生互换，称之为转换（transversion）；如果是嘌呤与嘧啶之间发生互换，称之为颠换（transition）。此外，点突变的表型效应是多样化的，根据点突变发生的性质和部位的不同，可进一步将其化分为以下几种类型：,1）、同义突变（cosense mutation）：也称沉寂或沉默突变（silent mutation）。由于遗传密码具有简并性，即同一氨基酸可由两种或两种以上密码子编码，而且同义密码间通常只有第3位碱基不同。如果点突变发生在第3位碱基位置，那么它就不会影响掺进蛋白质中的氨基酸，这也就是在某些情况下，DNA编码序列中碱基的取代虽然
42、导致了某一,密码子的改变，但所编码的氨基酸并未改变的原因。换言之，同义突变不会造成蛋白质一级结构的变化，但可形成基因多态性。除此之外，如果突变发生在DNA的非编码区或非调节区，则该突变也将是沉默突变，而且群体中许多沉默及非致死突变的积累会产生遗传多态性，即在“正常”DNA及其蛋白质序列中可接受的变异。,2）、错义突变（missense mutation）：基因编码序列中碱基的置换如果发生在密码子的第1或第2位碱基上，导致某密码子改变，并编码另一种氨基酸，则是错义突变。错义突变有可导致蛋白质结构与功能的变化，也可能仅有蛋白质结构的变化，而对其功能影响甚微。因为大多数蛋白质可以耐受其氨基酸序列中某
43、些非活性必需氨基酸的改变，特别是,当碱基变化导致两种性质相近的氨基酸发生替换时，如密码子CTT变为ATT，导致亮氨酸残基被异亮氨酸残基所取代，往往可使蛋白质活性不受影响。但是，如果蛋白质结构或功能活性的关键部位发生了氨基酸的改变，则极有可能产生突变体或造成致死性后果。镰刀型红细胞贫血症就是典型实例。,3）、无义突变（nonsense mutation）：指基因编码序列中碱基置换使氨基酸密码子转变为终止密码子的突变。这种突变可导致mRNA的转录及翻译过程提前终止，产生比原肽链截短并缺失了C末端的蛋白质产物。所以，无义突变常对编码蛋白质的活性有严重影响，容易产生突变体表型。,4）、终止密码子突变（
44、mutation of termination codon）：指基因的终止密码子发生碱基置换转变为一种氨基酸密码子，致使转录和翻译过程不能正常终止，结果形成一种比原肽链延长的异常蛋白质的突变。,5）、起始密码子突变（mutation of initiation codon）：指基因中起始密码子被置换，导致不能正常转录和翻译，无表达产物的突变。上述大部分发生在基因编码序列中的点突变，可引起蛋白质结构改变，但一般不影响基因的表达，少数情况下可伴有基因表达水平的降低。基因的非编码序列也可发生碱基置换突变，如启动子、增强子、内含子等区域内的突变，均可影响基因表达及表达调控。,2、缺失和插入突变（del
45、etion and insertion mutation）指在DNA编码区内丢失或增加3或3的倍数个核苷酸而导致的基因突变。这类突变的效应是使基因翻译至突变处时丢失或增加1个或数个氨基酸，而突变位点后的氨基酸序列并无改变。但是，如果插入或缺失涉及的核苷酸数目不等于3的倍数，将会造成突变点后全部密码子阅读框架,移位，进而翻译产生的氨基酸序列与正常蛋白质完全不同，或者使肽链合成提前终止或延长，产生无正常功能的异常蛋白质，这种基因突变称为移码突变。移码突变的结果是所翻译出的蛋白质序列从突变点起至C末端都完全被改变了，若此突变发生在有重要功能的基因中，常可导致生物个体死亡。,（三）、突变的意义基因突变
46、的效应是多种多样的。人们一般容易误认为突变对生命都具有危害作用。其实就其后果而言，突变在生物界普遍存在是有其积极意义的。1、突变是进化的分子基础 从生物进化史看，进化过程是突变不断发生所造成的，突变为进化提供了最根本、最原始的材料，没有突变就,不可能有现今五彩缤纷的生物世界。遗传学家甚至认为，没有突变就不会有遗传学。在进化过程中，DNA序列一定要经历改变，新序列必需加入到生物的基因组中，才可能使生物进化发展。虽然在一个短暂的历史时期内，人类很难亲眼看到某一物种的自然演变过程，而只能看到长期突变积累所造成的结果。但是通过化石的比较研究，人们发现不同生物物种的历史存在状态是不同的。有的,物种随着时
47、间的推移发生了显著的形态结构变化，从一个物种变成了另一个物种；有的原始种群产生了剧烈的形态结构的歧化，由一个物种演变出两个以至更多的物种；有的物种在历史的演进过程中灭绝消失。此外，同一物种个体间存在的差异也表明，突变在自然界普遍存在。大量研究结果表明，动植物及微生物中很多单位性状内的差别，都来自,该生物进化过程中的基因突变。例如，水稻由非糯性变为糯性，小麦由高秆变为矮秆等性状都是基因突变的结果。又如流感病毒就有很多不同遗传变异型的毒株，不同毒株的感染方式、毒性大小有可能相差很大，因而给流感的预防带来相当大的困难。,2、突变可产生遗传多态性 多态性（polymophism）一词是用来描述个体之间
48、基因型差别现象的。只有基因型改变而没有可察觉表型改变的突变，是导致DNA多态性形成的原因。如前所述的简并密码子中第三位碱基的改变，以及蛋白质非功能区段上编码序列的改变等等。由于许多DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会,产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。研究表明，RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某突变基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可用这一多态性片段作为一种“遗传标志”进行分析和诊断。例如，法医学上的个体识别和亲子鉴定；医学上器官移植的配型及个体对
49、某些疾病的易感性分析，都要用DNA多态,性分析技术。此外，利用核酸杂交原理，还可以设计各种技术用于识别个体差异和种、株间差异的分析。3、致死性突变可用于消灭有害病原体突变发生在对生命过程至关重要的基因上可导致个体或细胞的死亡。人类常利用这种致死性突变消灭有害病原体，以达到灭菌的目的。,4、突变可创造新类型物种突变可改变物种的基因型，从而形成新性状。现代物种形成与进化理论已为突变育种新技术奠定了理论基础。目前辐射育种和化学诱变育种，以及突变体的筛选等技术已得到广泛运用，并已培育出许多优良品种。,5、突变是某些疾病的发病原因 这些疾病包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的疾病，一般人认为突变有害，指的就是
50、这种类型的突变。现今最详细的内科学记载了4000余种疾病，其中有三分之一以上的疾病属于遗传性疾病或有遗传倾向的疾病。有少数遗传性疾病已知其遗传缺陷所在，如血友病是凝血,因子基因的突变，地中海贫血是血红蛋白基因突变等等。有遗传倾向的疾病包括常见的高血压、糖尿病、溃疡病、肿瘤等。可以肯定这些疾病与生活环境有关，但也有证据表明存在某些基因的变异，而且涉及的基因不是少数几个，而是众多基因与生活环境因素共同作用的结果。,Real examples of deletion mutations which cause diseases,In CFTR gene,In CFTR gene,In FIX gen
