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1、尼克酰胺（NA）在细胞内金属运输和植物生殖发育过程的作用Role of Nicotianamine in the Intracellular Delivery of Metals and Plant Reproductive Development,Michiko Takahashi，Yasuko Terada，Izumi Nakai Laboratory of Plant Biotechnology,University of Tokyo,Japan Department of Applied Chemistry,Science University of Tokyo,Japan The P
2、lant Cell,Vol.15,12631280,June 2004,1 Introduction 2 Methods 3 Results 4 Discussion,1 Introduction,1 尼克酰胺（Nicotianamine，NA），是一种金属螯合剂，普遍存在于高等植物中，NA可螯合金属阳离子。研究认为NA在植物体内Fe和其他金属的运输过程中起作用。NA也可能与Fe（）作用保护细胞免受氧化胁迫的伤害。但是，在高等植物中NA准确的作用仍不清楚。,2 尼克酰胺氨基转移酶（Nicotianamine aminotransferase，NAAT）催化NA的氨基转变，在禾本科植物中，NAA
3、T是获得Fe所必需的。NAAT为禾本科植物所特有。,3 麦根酸类植物高铁载体（Mugineic acid family phytosiderophores，MAs），由禾本科植物根系分泌，它是一类低分子量的非蛋白氨基酸，可溶解土壤中的Fe，是天然的Fe螯合肽。NAAT是MAs合成过程中的关键酶(Fig 1)，催化NA的氨基化，是MAs生成过程中的一个基本媒介，MAs只有在禾本科植物中产生。注：在缺铁胁迫下，禾本科植物根系分泌出MAs，活化土壤中难溶的三价铁化合物，然后在专一的转运蛋白的作用下将Fe3+-MAs 转运进胞质中，从而被植物利用。,4 MAs的生物合成途径,为了研究非禾本科植物中NA
4、AT产生异常的原因，把包含花椰菜病毒的35S启动子与hvnaat-A基因编码区结合的载体转入烟草（产生NA但是不产生植物铁载体），表达NAAT基因的转基因烟草植物（naat烟草）的幼叶有网纹状失绿症，花的形状异常且不育，naat烟草可产生大量的NAAT，从而使得NA短缺。本文描述转基因烟草表达大麦NAAT基因和在植物中NA消耗的表型，并试探就NA在细胞内金属运输和植物生殖发育过程的作用。,2 Methods,1 二元载体构建：缺铁大麦根部中分离hvnaat-A cDNA 在pUC118菌株SmaI位点克隆pUC118-hvnaat-A用XbaI 和SacI进行融合克隆在pIG121Hm 菌株中
5、。,2 植物材料和生长条件：1）通过三亲株交配二元载体pIG121Hm-hvnaat-A 被引入到根瘤农杆菌株C-58烟草中进行转化和再生离体烟草腋芽T0嫁接到nas烟草上收获naat烟草T1的种子在nas烟草上继续嫁接获得T2。2）Naat烟草（T2），nas烟草，野生型烟草和对照烟草生长在装有蛭石的盆里，条件为25C(day/night)，自然光照，每天用稀释1000倍的Hyponex 营养液浇灌植物，培养后作为实验材料。注：Nas烟草也是转基因植物，是使用具有花椰菜病毒35S启动子-hvnas1基因插入pBIGRZ1菌株转化而成，并被证明超表达NAS（nicotianamine synt
6、hase）基因。,3 DNA凝胶电泳分析：DNA的提取分离电泳扩增杂交拍照4 RNA凝胶电泳分析：RNA的提取变性电泳扩增杂交拍照5 尼克酰胺氨基转氨酶（NAAT）的分析：用HPLC分析6 叶片的显微结构和超微结构观察：环氧树脂切片法7 金属浓度的测定：发射光谱仪测定8 金属在叶片中的分布：同步加速器诱导辐射X-射线荧光光谱仪（XRF）观察,9 NA的提取和分析：用HPLC进行定量分析 10 失绿叶叶绿素的测定：用SPAD-502叶绿素仪测定 11 花型异常的逆转实验：离体腋芽用五个溶液处理：(1)0 M NA+20M 柠檬酸Fe(III)；(2)20M NA+20 M FeCl3，(3)20
7、M NA+20M FeSO4，(4)20M NA+20M柠檬酸Fe(III)，(5)100M NA+20 M 柠檬酸Fe(III),12 Naat烟草在nas烟草上的嫁接：以nas烟草为砧木，去除叶子，把naat烟草嫁接于上(Figure 9A)。进行两次嫁接试验以获得足量的种子。最后，再嫁接离体烟草（T2naat烟草）进行分析。,3 Results,1 大麦naat-A基因在烟草中的整合及其表达,2 转基因烟草（naat烟草）的表型具失绿症,幼叶失绿症是植物金属缺乏的普遍症状。因此，作者通过电感耦合等离子发射光谱仪测定了naat烟草和对照叶片中的四种金属（Cu、Fe、Zn和Mn）的浓度和分布
8、。,3 叶片中金属的浓度和分布,naat烟草叶片中金属水平的降低表明植物内部金属的运输已经改变。因为NA是NAAT的酶作用物，可以想象NAAT的大量产生消耗了这个部位的NA，内源NA的短缺导致naat烟草内部金属的运输产生缺陷。为此，作者测量了naat烟草和对照烟草叶片的内源NA。,4 naat烟草中NA的浓度,5 NA-Fe处理失绿症被逆转 为了验证naat烟草的失绿症是由于NA的短缺所造成的，供给naat烟草Fe或Fe+NA。离体的naat烟草用以下五种溶液处理：（1）FeCl3，（2）FeSO4（3）柠檬酸铁（4）FeCl3+NA（5）FeSO4+NA,Fig6 naat烟草失绿症的逆转
9、实验,(D)SPAD values and concentrations of metals in young naat tobacco leaves treated with the five solutions.Fig6 naat烟草失绿症的逆转实验,上述结果显示虽然NA和柠檬酸盐可促进Fe向幼叶运输，但只有NA促进Fe向失绿区运输。用柠檬酸铁处理的幼叶的SPAD 值比用FeSO4、FeCl3的高，这个结果也表明，在螯合剂（NA和柠檬酸盐）缺乏的情况下，Fe的运输很小。再者，用含有NA的铁盐溶液处理的幼叶Cu、Zn、Mn的浓度也很高，这也表明NA也促进这些金属的运输。,因为只有NA-Fe溶
10、液逆转了naat烟草的失绿症，使用59Fe去探究NA是否促进叶内Fe的运输。用NA-59Fe或者不加NA的59Fe处理离体的naat烟草腋芽，处理6h后，叶片中的59Fe通过放射能照像可显示出来（Fig6E）。,(E)Uptake and distribution of 59Fe in naat tobacco leaves treated without NA（-NA+59Fe)or with NA（+NA+59Fe）for 6 h(analysis performedin duplicate).Fig6 naat烟草失绿症的逆转实验,6 不正常的花型和不育1）野生型与对照烟草表型：五个花瓣
11、，花色粉红，花粉在开花以前释放，圆锥花序或聚伞形花序顶生，孢蒴卵形。2）Naat烟草表型：有两种类型的异型花。Type-I 的花与The type-II 的花。,1）Type-I 的花：开花早，花蕾形状异常，烟草的第一个花蕾最不正常，并且 type-I的花比野生型的花有更大更厚的萼片。A 放射花瓣，花瓣丝状。B 花器官异常：花瓣状萼片、雄蕊，花瓣与花丝融合 C 花冠开裂 D 花器官数量不正常：雄蕊、花瓣和心皮 数量不正常（多或少）E 混合花：两个花共有萼片，或几个特征的混合。,6 不正常的花型和不育Figure 7.Inflorescences of Wild-Type Tobacco and
12、 Type-I naat Tobacco.,2）type-II 的花：发育明显不同于type-I 花，开花晚，type-II的花与野生型的花有一些相似的特征，有正常花型，萼片、雄蕊、花瓣颜色相近，并且花粉囊产生少量的花粉。,Figure 8.Inflorescences of Wild-Type Tobacco and Type-II naat Tobacco.,在 naat 烟草中，两种类型的花产生的花粉数量少，花粉在花开放几天后释放。花粉粒没有充满花粉囊，花粉粒形状像箭头，花丝是粉色而不是白色。与野生型烟草相比，在naat烟草花的花粉囊的横向部分显示有少量的花粉，这些花粉没有发育。另外，畸
13、形的雌蕊或长或短，且经常观察到柱头形状不规则，所有的 naat烟草植物 的叶表现为失绿症且不育。,作者通过野生型烟草和naat 烟草杂交来探究生殖器官不育的可能原因。野生型花粉被涂到naat烟草的柱头上，或者naat烟草的花粉被涂到野生型花粉的柱头(Table1)。,杂交结果：野生型烟草雌蕊naat 烟草花粉：孢蒴中的种子量少，但都成熟了。相反，野生型烟草花粉naat 烟草雌蕊：产生11个孢蒴，只有一个有少量种子。这些种子小而轻且为棕色。这表明naat 烟草的雌蕊和雄蕊都有完成受精的能力。但是，在naat 烟草中花粉的数量不能有效的完成生殖，而且naat 烟草的雌蕊由于缺少NA使得金属供应短缺
14、，故不能产生成熟的种子。因此，naat 烟草的不育出现了三个结果，（1）花粉产量少，（2）花粉囊开裂晚，（3）受精之后卵不成熟。,7 生殖器官形态异常通过NA处理被逆转 为了探究内源NA短缺是否导致花序的形态异常，与Fig6A的描述的方法相同，除了改变NA的浓度，供给naat烟草NA，离体naat烟草用五个溶液处理(Table 2)100MNA和20M柠檬酸铁可逆转这种形态异常,A 20M柠檬酸铁 B 100MNA+20M柠檬酸铁,8 通过嫁接育性被恢复（Fig 10）为了检测内源NA短缺是否会导致不育，把naat烟草嫁接到野生型烟草上或者转基因植物nas烟草上（超表达大麦烟碱酰胺合酶基因Hv
15、NASl）naat烟草嫁接到野生型烟草上后尽管幼叶的失绿症被恢复，但育性不能被恢复；花粉囊部分正常，但种子不成熟（文中没有显示数据）。嫁接在nas烟草上的naat烟草恢复了育性，且叶片没有失绿症。,Figure 10.Recovery from Sterility by Grafting.,Figure 10.Recovery from Sterility by Grafting.,Figure 10.Recovery from Sterility by Grafting.,由上图可知嫁接在nas烟草上的naat烟草恢复了育性，且叶片没有失绿症。另外，大多数花粉囊正常，粉红色的雄蕊花丝逆转为白
16、色，花粉粒完全发育，种子成熟。然而，多数种子发育不完全，且种皮皱缩，成熟种子的数量下降。从嫁接植物获得的成熟种子发芽正常，但是幼苗的叶片有失绿症，花序形态不正常且不育，(数据没有显示)。说明育性与NA有极大的关系。,9 嫁接在nas烟草上的naat烟草各器官的金属浓度（Fig11）,这些结果表明，把naat烟草嫁接在nas烟草上后可提供naat烟草NA，因此naat烟草花的Fe、Cu、Zn都有明显的升高。,10 NtNAS表达(Fig12)RNA凝胶电泳分析探究了在烟草花中的NAS表达（Figure 12）。本文分析了开花第一天成熟花蕾的四种花器官（花瓣、花丝、雌蕊、花粉囊）。NtNAS 在所
17、有花器官中都得到了表达，这比表明花序中产生的NA是正常花发育所要求的。尤其，NtNAS在雄蕊花丝中的高度表达表明在运输金属给花粉囊的过程中NA具有重要作用。,4 Discussion and possible conclusion,1 naat烟草的表型与NA有关 表达大麦naat-A基因的naat 烟草幼叶具有明显的NAAT活性，这导致NA在这一部位被严重消耗。因此，内源NA在naat烟草中没有被检测到，而在对照中含量显著。这表明naat 烟草的表型主要是内源NA缺乏的结果。,2 NA是Fe在叶脉间以及叶脉到交错区运输所必需的(1)在naat烟草幼叶的四种金属，尤其是Fe和Cu的浓度比对照烟
18、草叶的低。再者，在对照烟草叶中，Fe主要分布在叶脉和幼叶的失绿区，相反，在naat烟草中，在叶脉只有少量的Fe，在失绿区Fe的数量极少，这个结果表明，naat烟草幼叶缺铁，故可得出结论，naat烟草幼叶失绿症是由于运输到叶片的Fe不足所致，尤其在失绿区。,(2)单一用Fe处理naat烟草，失绿症不能逆转，柠檬酸铁处理增加了幼叶的Fe含量，但是也不能逆转失绿症，表明柠檬酸盐可运输Fe到幼叶但是不能到达失绿区。Fe+NA的处理增加了Fe的浓度并且逆转失绿症。添加外源的59Fe和NA时，59Fe立即被运输到naat烟草幼叶的叶脉和失绿区。这些结果表明NA加强了Fe向幼叶叶脉和失绿区的运输。,(3)添
19、加NA的溶液处理幼叶也增加了Cu和Zn 的浓度，表明NA也促进这些金属向幼叶运输。在naat烟草中的四种金属浓度，在幼叶和花中，下降的顺序都相似，依次为Mn ZnFeCu。在naat烟草中金属浓度的下降可归于内源NA的亏缺。,3 NA是生殖生长和受精必需的 100MNA+柠檬酸铁的处理，可克服花形态异常、花粉成熟缺陷和花粉囊晚开裂。如果在某一部位NAAT没有消耗NA，浓度小于100M的NA可能会逆转花的形态异常。因此，低浓度的NA影响花的形态。由此可得出一些重要的结论：正常花发育比正常的叶发育要求更高的NA浓度。在生殖时期柠檬酸盐不能代替NA，也不能作为Fe养份从幼叶叶脉转运到失绿区。NA和F
20、e都是花正常发育所必需的，并且同时添加NA和柠檬酸铁对正常的花发育是有效的。Cu和Zn也参与正常的花发育。,嫁接在野生型烟草上的naat烟草可以逆转失绿症和花型异常，但是不能逆转不育。嫁接在nas烟草上的naat烟草可逆转幼叶的失绿症、花型异常、花粉成熟缺陷、花粉囊晚裂和不育。因为野生型烟草产生的NA比nas烟草的少（数据没有显示），可能是野生型烟草产生的NA的量不能有效补偿NAAT消耗的内源NA，从而没有足够的NA运送到种子。嫁接在nas烟草上的naat烟草花的Fe、Cu、Zn的浓度都增加了，且nas烟草花中的Fe、Cu、Zn比野生型的高。但nas烟草中Cu的浓度不高，表明NA可能参与Cu的
21、动态平衡。嫁接试验的结果表明，种子成熟比叶和花的正常发育需要的NA多，而且NA影响花中的金属浓度。这些结论表明NA是正常花序形成、正常花粉产生和种子成熟所必需的。,4生殖时期金属的重要性 Fe、Cu、Zn、和 Mn在植物生殖阶段是很重要的，因为在这个时期，这些金属是许多关键蛋白的组分。在naat烟草中雌蕊长度异常可能是由于Fe缺乏导致酶合成紊乱所致。,5 NA充当金属载体 naat烟草中的嫁接实验和金属浓度显示NA促进Fe、Cu、Zn向花器官和种子运输。花器官中NtNAS的表达也表明NA促进金属向花序运输。尤其NtNAS 在雄蕊花丝的表达说明花粉囊花粉的成熟需要NA来运输金属。在幼叶和花中，柠
22、檬酸盐不能代替NA。这些结果表明，NA通过存在于幼叶、花序和种子中特异的NA-金属载体运输金属到生殖器官细胞。,6 NA可能影响Zn-指蛋白的作用 Naat烟草的不育可能与这些Zn指蛋白有关系，由于NA的短缺而导致缺Zn，影响Zn指蛋白的作用，从而导致不育。另外，如果NA作为细胞间金属载体而起作用，NA的缺乏可能抑制Zn到蛋白质的准确转运或者抑制Zn从蛋白质上脱离，FIL是参与形态发生的Zn指蛋白之一，FIL是决定花正确数量和位置的关键蛋白。Naat烟草的花表型异常可能与FIL的正常表达有关。NA和EDTA一样，是金属的螯合剂，可能是通过NA供应或者去除Zn来调节Zn指蛋白。这种可能性表明NA
23、影响细胞内转录因子的相互作用。,7 NA影响Fe结合蛋白的作用 NA可能调节Fe结合蛋白中的Fe，它主要在雌配子体的中央细胞、胚乳的起源中表达，它的DNA糖基化结构域有一个(4Fe-4S)2+。胚乳基因和种子育性需要Fe结合蛋白。NA也可能影响开裂。缺铁花的花粉囊正常开裂，即使有少量花粉。相反，由于需求茉莉酸，naat烟草延缓花粉囊开裂。因为丙二烯氧化合酶是茉莉酸生物合成的一个关键酶，此酶有亚铁血红素-Fe，它可能受NA影响。折中一下，NA可能直接影响花粉囊壁的干燥。,总之，我们展示了NA的各种作用，尤其是生殖阶段的作用。长期以来，已经假设NA是Fe、Zn和Mn经由韧皮部进行再分配所必需的，也是Cu在木质部进行运输所必需的。这个研究显示在金属转运过程中NA的作用是幼叶正常作用、生殖器官发育和能育性所必需的。另外，我们也指出NA可能是细胞内调节金属结合蛋白（诸如Zn指蛋白）所必需的。,请大家点评，谢谢！,
