PCR扩增反应的基本操作及理论知识.docx

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1、PCR扩增反应的基本操作及理论知识第一节移液器的使用一、移液器的工作原理移液器的工作原理是活塞通过弹簧的伸缩运动来实现吸液和放液。在活塞推动下， 排出部分空气，利用大气压吸入液体，再由活塞推动空气排出液体。使用移液器时， 配合弹簧的伸缩性特点来操作，可以很好地控制移液的速度和力度。二、移液器的操作使用1. 移液器规范操作步骤第一步设定移液体积从大体积调节至小体积时，为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可，从小体积调 节至大体积时，可先顺时针调至超过设定体积的刻度，再回调至设定体积，可保证最 佳的精确度。（见图1）第二步装配移液器吸头：将移液器端垂直插入吸头，向右微微转动（视具体移液器而定，eppe

2、ndorf可以左右微 微转动），上紧即可；特别提示：用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的，长期这样操作，会 导致移液器中的零部件因强烈撞击而松散，甚至会导致调节刻度的旋钮卡住。（见图2） 第三步吸液和放液吸液!吸头尖端需浸入液面3 mm以下!慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度!放液时吸头尖端靠在容器内壁2. 移液小技巧预润湿吸液粘稠液体可以通过吸头预润湿的方式来达到精确移液，先吸入样液，打出，吸头 内壁会吸附一层液体，使表面吸附达到饱和，然后再吸入样液，最后打出液体的体积 会很精确。正向吸液与反向吸液正向吸液是指正常的吸液方式（见图4），操作时吸液可将按钮按到第一档吸液， 释放按钮。放液

3、时先按下第一档，打出大部分液体，再按下第二档，将余液排出。反向吸液（见图5）是指吸液时将按钮直接按到第二档再释放，这样会多吸入一些 液体，打出液体时只要按到第一档即可。多吸入的液体可以补偿吸头内部的表面吸附， 反向吸液一般与预润湿吸液方式结合使用，适用于粘稠液体和易挥发液体。从大到小的剧节从小刊大的i周宜uu wd正向眼派图2AHJI，J5： 反间吸渔口/匕G3. 错误的操作方式错误：装配吸头时用移液器反复撞击吸头，以上紧正确：插入吸头，左右轻转旋转上紧吸头错误：吸头与移液器不匹配，影响气密性正确：选用与移液器匹配的，有质量保证的吸头错误：吸液时，移液器倾斜吸液正确：垂直吸液错误：吸头内含有未

4、打出的液体时，移液器平置于桌面正确：将移液器垂直挂在移液器支架上错误：用大量程的移液器移取小体积的液体正确：移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内才符合不准确度和不精确度 的要求错误：吸取具有强挥发性的液体正确：如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让蒸 汽挥发，同时，建议使用外置活塞式移液器。错误：吸液速度和放液速度过快正确：慢吸慢放三、实验室内移液器的自行快速检测移液器在使用过程中，如果怀疑其精确度，可根据以下提示自行检测：怀疑一：移液器是否有漏气？1. 自行检测：目视法检测:将吸取液体后的移液器垂直静置15秒，观察是否有液滴缓慢的流出。 若有流出，说明有漏气现

5、象。2. 可能的原因：- 吸头是否匹配？使用原装匹配的吸头- 装配吸头时有无上紧？- 移液器内部气密性不好？怀疑二：液体、移液器、吸头以及环境的温度差异是否会影响移液器的准确度？移取液体的温度与吸头和移液器的温度不一致的情况下，液体温度高于吸头的，移取的液体体积会偏大，液体温度低于吸头的，移取的液体体积会偏小。怀疑三：液体样品的密度和水是否有非常明显的区别？移液器出厂前的校准是用水作为标准液进行测试的，如果所操作的液体与水的比 重有很大差异，所给出的不精确度和不准确度就不能满足，从而产生误差。怀疑四：吸液速度太快，是否会导致移液体积不准确？吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确。ps

6、：移液器长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，延长移液器的 使用寿命。第二节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应(PCR)的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组 DNA)的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术， 在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。PCR基本原理：是以基因组DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在 的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩 增。在微量离心管中，加入与待扩增的D

7、NA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的 缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、DNA聚合酶、Mg2+等。因此参与PCR反应的 物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。1. 引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要 紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的 非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。引物的选择将决定PCR产

8、物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有 关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也 能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产 物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。 当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的 共溶剂如二甲基亚飒、甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR 的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。(1) 引物长度PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一

9、般为15-30bp，常用的是 1827bp，但不应大于38bp。引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很 好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大 于74C，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。(2) 引物碱基构成引物的G+C含量以4060%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含 量不能相差太大。其Tm值是寡核昔酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双 链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4 (G+C) +2 (A+T) 估计引物的Tm值，则有效引

10、物的Tm为5580C，其Tm值最好接近72C以使复性条件最 佳。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌吟或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超 过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。(3) 引物二级结构引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物 和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的 3末端形成的二聚体，应控制其AG大于 -5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结 构的可能性，引物中间或5端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以3端或近3 端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结

11、构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外， 与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3末端有发卡结构的引物。(4) 引物3端序列引物3,末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3末端最后 5到6个核昔酸的错配应尽可能的少。如果3末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补 偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。引物3末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其 是在3末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是 引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩 增成功。引物3

12、末端的稳定性由引物3末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的AGo AG 值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，此值的 大小对扩增有较大的影响。应当选用3端AG值较低(绝对值不超过9)，负值大，则3末端 稳定性高，扩增效率更高。引物的3端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA聚合反应。需要注意的是，如扩增编码区域，引物3,端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个 碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基Ao(5) 引物的5,端引物的5,端限定着PCR产物的长

13、度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不 影响扩增的特异性。引物5,端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等； 引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对 于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在 用于表达研究的目的基因的克隆工作中。(6) 引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待 扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。(7) 引物稀释通常引物稀释会稀释成1020pM，也不排除做其他的用途使用，如Oligo (dT)、Random P

14、rimer均稀释为50pM。2. 酶及其浓度Taq DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离的。 Taq DNA聚合酶是一个单亚基，分子量为94000 Da。具有5-3的聚合酶活力，5-3的外 切核酸酶活力，无3-5的外切核酸酶活力，会在3末端不依赖模板加入1个脱氧核昔酸(通 常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体)，在体外实验中，Taq DNA聚合酶的出错 率为10-410-5。此酶的发现使PCR广泛的被应用。此酶具有以下特点：(1) 耐高温，在70C下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93C下反应2小时后 其残留活性是仍能保持60

15、%，而在95C下反应2小时后为原来的40%。(2) 在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。(3) 一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb，且特异性也较高。PCR的广泛应用得益于此酶，目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶，有用于长片 段扩增的酶，扩增长度极端可达40kb；有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶；还有针 对不同实验对象的酶等。一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u (总反应体积为50 l时)，浓度过高可引起非特异 性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3. dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不

16、当易变性 失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCl 的缓冲液将其pH调节到7.07.5,小量分装，-20C冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。4. 模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通 常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质， 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋 白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿

17、抽）抽提 除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于PCR反应。 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白 质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。模板DNA投入量对于细菌基因组DNA 一般在110ng/r l，实验中模板浓度常常需要优化， 一般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。在PCR反应中，过高的模板投入量 往往会导致PCR实验的失败。5. Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度 为200mol/l时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/l为宜。Mg2

18、+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。一般厂商提供的Taq DNA聚合酶均有相应的缓冲液，而Mg2+也已添加，如果特殊实验应采用无Mg2+的缓冲液， 在PCR反应体系中添加一定量的Mg2+。常用的反应体系如下:试剂使用量TaKaRa Taq (5 units/pl)0.25pl10xPCR Buffer (Mg2+ free)5plMgCl2 (25mM)3pldNTP Mixture (各 2.5 mM)4pl引物F0.2 - 1.0 pM (final conc.)引物R0.2 - 1.0 pM (final conc.)模

19、板 MHHH4H1H1H邮 IMtF : i如.-/ ! r 、: -pI?顷皿Eli ;，_i - W：i i.S 戒就顷T：i!, ，图PCR的反应过程1. 模板DNA的变性模板DNA加热到9095C时，常用94C,双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链， 称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有 关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解 链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、 G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲

20、基亚飒 (DMSO)，并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97C，时间适当延长，即所谓 的热启动。2. 模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至3765C时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板- 引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核昔酸的碱基 组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长 度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度 要快得多，退火时间一般为30sec2min。3. 引物的延伸DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶

21、序列为模板， 按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延 伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延 伸所需要的时间取决于所扩增模板DNA的长度。在72C条件下，Taq DNA聚合酶催化的合 成速度大约为4060个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。 在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就2 的指数倍增加。每完成一个循环需24min，一次PCR经过3040次循环，约23h。扩增 初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时

22、，酶的催化反应趋 于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可 用Y=(1+X) n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效 率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论 值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的 DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称 平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。 大多数情

23、况下，平台期的到来是不可避免的。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在 两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的 模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模 板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长 产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物 片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸 的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列

24、以内、形成长短 一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则 以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够 纯DNA片段供分析与检测用。二、PCR反应特点PCR反应具有以下特点：1. 强特异性PCR反应的特异性决定因素为：（1）引物与模板DNA特异性的结合；（2）碱基配对原 则；（3） Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；（4）靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对 原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合 （复

25、性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很 高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。2. 高灵敏度PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-i2g）量级的起始待测模板扩 增到微克（g = 10-6g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达3个RFU （空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。3 .快速简便PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行变 性一退火一延伸反应，反应一般在24小时完成。扩增产物常用电泳分析，操作简

26、单易推广， 如采用特殊PCR仪（荧光时时定量PCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。4. 低纯度模板不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。可直接 用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。第三节PCR扩增反应的实施一、PCR反应的条件PCR反应条件为温度、时间和循环次数。1. 温度与时间的设置基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温 度点法，双链DNA在9095C变性，再迅速冷却至4060C，引物退火并结合到靶 序列上，然后快速升温至7075C，在Taq DNA聚合酶的作用下，

27、使引物链沿模板 延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退 火与延伸温度可合二为一，一般采用94C变性，65C左右退火与延伸(此温度Taq DNA 酶仍有较高的催化活性)。另外，当扩增片段较长，引物退火温度较高，一般高于65C， 也通常使用二温度点法，能够提供扩增片段的特异性。(1) 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。 一般情况下，93C94Clmin足以使模板DNA变性，若低于93C则需延长时间，但 温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产 物完全变性，就会导致PCR失败。(2) 退

28、火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变 性后温度快速冷却至40C60C，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物 复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温 度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20 个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55C为选择最适退火温度的起点较为理想。另外，引物的退火温度，一般在合成引物的时候，引物合成报告单中，都有已经 计算好的退火温度。常用的引物退火温度计算公式【Tm值(解链温度)=4(G+C) + 2(A +T)复性温度=Tm值-(510C)】，依本人经验，不是很准确。

29、在Takara公司合成的引 物，退火温度需另算，要是在生工合成引物的引物报告单的退火温度是比较准确的。 如果遇到上游引物和下游引物的退火温度有几个温度梯度之差时，5摄氏度以内的， 通常使用两个引物退火温度数值的平均数；5摄氏度以外时，首先要考虑的是使用tou chdown法，忽略引物退火温度差，二次循环时，采用两个引物退火温度平均值。在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性 结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间 完全结合。(3) 延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080C，150核苷酸/ S/酶分子；7

30、0C，60核苷酸/S/酶分子；55 C，24核苷酸/S/酶分子；高于90C时，DN A合成几乎不能进行。(4) PCR反应的延伸温度一般选择在7075C之间，常用温度为72C，过高的 延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度 而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需3 4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低 浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。2. 循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般 的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，

31、非特异性产物的量亦随之增多。二、PCR扩增产物分析PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与 鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不 同的分析方法。1 .凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB漠乙锭染色（EB替代物）紫外仪下观察， 初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致。（1）琼脂糖凝胶电泳：通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。电泳具体方 法如下： 1%的琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖于锥形瓶中，用量筒量取100mL 1XT AE buffer，加热至融化，稍微冷却加入6以的EB替代物，然后将胶导入插入梳子的

32、模具中，冷却。 拔去梳子，将胶移至电泳槽中，让电泳液没过凝胶孔； 向凝胶孔中，加入PCR产物（小胶十一孔和大胶二十五孔均需要加入5pl样品） 以及 DNA Marker ； 盖上电泳槽盖，接通电源，130V，25min （或者120V，27min）； 电泳结束后，将胶去除，放置于紫外仪下，进行观察。（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条 带比较集中，可用于科研及检测分析。2.核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。三、注意事项 注意移液器的使用，尤其是每吸一种液体加入到反应管中，一定要换吸头。 在引物稀释时，一定主要稀释倍数，弄明白常用引物使用单位

33、，如四M、pmol、 nmol、pmol/L 等。 加完样品，放进PCR仪扩增前，反应管内一定不要有气泡。如果反应体系液体 没有混匀，不要紧，千万不能在反应体系内留有气泡，影响PCR扩增。 跑完电泳后，及时处理样品，切勿污染操作环境。 扩增结束后，PCR产物应当天做，短暂保存至于4C冰箱，长久保存放置于-20C 冰箱。 PCR扩增所用到的酶，最好是现用现从-20C冰箱中取出，用完后立即放回。 按照操作加入各种试剂，切不可以多加。第四节PCR结果异常分析PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。在琼脂糖凝胶电泳中，没有检测出PCR产物扩增

34、结果，有以下几种情况：1. PCR产物和Marker均没有条带首先考虑的是，琼脂糖凝胶问题。所用的是不是琼脂糖做的胶，因为琼脂糖和普 通琼脂还是有很大的差异的，琼脂糖是经过深加工的，粉状比较精细，加热容易融化， 但里面几乎没有其他杂质；而琼脂粉，常用作细菌固体培养基，起媒介支撑作用，但 不能用于核酸电泳。另外，还需要考虑琼脂糖凝胶的浓度，DNA片段与琼脂糖凝胶浓 度大小关系如下表：凝胶浓度（%）线性DNA长度（bp）0.51000300000.7800120001.0500100001.240070001.520030002.0502000其次是要考虑是否添加了核酸染料。出现Marker和PC

35、R产物均没有条带，优先怀 疑的就是琼脂糖凝胶中是否添加了核酸染料。以前，实验室尝试在胶中加入EB染料 来显色；现如今，实验室已经使用EB替代物核酸染料（北京市东盛泰博科技有限公 司），效果也不错，100ml琼脂糖凝胶需要加入5.3 m的EB替代型核酸染料，汇总如 下：琼脂糖凝胶量（mL）EB替代型核酸染料量（“D170.9351.8603.21005.32.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有：模板核酸的制备；引物的质量与特异性；酶的质 量及活性；PCR循环条件；PCR产物特异性扩增量不够多。寻找原因亦应针对 上述环节进行分析研究。（1）模板：模板中含有杂蛋白质；模板中含有Taq酶抑制

36、剂；模板中蛋白 质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；在提取制备模板时丢失过多，或吸入 酚；模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本 的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其 程序亦应固定不宜随意更改。（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失 或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或漠乙锭。（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或 扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物 一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为

37、： 选定一个好的引物合成单位，还有事引物纯化方式。 引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度（此步引物合成公司进行校检）。 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物 变质降解失效。（通常合成2管，一管使用，另一管备份。） 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PC

38、R 扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。（5）反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20皿、30皿、50皿或100皿 用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20皿后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。（6）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短， 极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温 度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计， 检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之

39、一。（7）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因 靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。（8）特异性产物不多：由于基因组模板量太多，各种DNA均有，使用引物扩增 时，容易出现扩增非特异性PCR产物较多，导致在凝胶电泳也检测不出来。像这种情 况，我们通常做套式PCR扩增，即先使用外套引物扩增，再使用外套PCR产物做模 板，进行内套PCR扩增。两次PCR扩增能够提高特异性片段扩增。3. 假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。可 能的原因是：（1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而

40、在进行 PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出 现假阳性。需重新设计引物。（2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大 片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔， 防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试 剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加 标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸 污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可 扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生

41、，可用巢式PCR方法来减轻或消除。4 .出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩 增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互 补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环 次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源 的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计 引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环 次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93C变性，65C左右退火与延伸）。5 .出现片状

42、拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的 质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对 策有：减少酶量，或调换另一来源的酶；减少dNTP的浓度；适当降低Mg2+ 浓度（更换为可调节Mg2+含量的反应体系）；增加模板量，减少循环次数；提高 反应退火温度；降低循环次数。6.其他情况所有出现的情况均不能有效解决，多数可能是PCR仪问题。第五节常用酶使用1、Takara taq 酶(Takara, R001A)试剂使用量TaKaRa Taq (5 units/p1)0.25p110xPCR Buffer (Mg2+Plus

43、)5p1dNTP Mixture (2.5 mM each)4p1引物 F (10 pM)1p1引物 R (10 pM)1p1模板1p1ddH2O17.25p12、PCR MasterMix (天根，KT201)试剂使用量2xPCR MasterMix12.5p1引物 F (10 pM)1p1引物 R (10 pM)1p1模板1p1ddH2O9.5p1多反应体系如下：试剂34567892xPCR MasterMix37.55062.57587.5100112.5引物 F (10 pM)3456789引物 R (10 pM)3456789模板1111111ddH2O28.53847.55766.57685.53、Takara PrimeSTAR GXL polymerase (Takara, R050A)高保真酶试剂使用量5x PrimeSTAR GXL Bufferffer (Mg24plus)10pldNTP Mixture (2.5 mM each)4p!引物F (10 pM)川1引物 R (10 pM)1p1Template1p1PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/ pl)1p1ddH2O32p1