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1、2023程序性细胞死亡方式在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征发病机制中的研究进展(全文)急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)的病死率一直居高不下，其治疗一直是医学领域的研究难点。凋亡、坏死、自噬性细胞死亡等细胞死亡方式被认为是ALI/ARDS的潜在机制，但其相关的炎症反应及介质释放均不能充分解释ALI/ARDS的炎症现象。近年来,铁死亡、坏死性凋亡、NETosis等程序性细胞死亡方式为ALI/ARDS提供了新的研究方向。铁死亡特点是铁依赖性脂质过氧化，导致细胞死亡和氧化应激。最近研究
2、表明，铁死亡抑制剂Ferrostatin-I可通过抑制脂质过氧化和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathioneperoxidase4,GPX4)减少ALI的发生。病原体感染、缺血、缺氧等病理性因素可导致肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等多种细胞发生坏死性凋亡并释放炎症介质,而孤J版受体4A1介导的线粒体融合可能是坏死性凋亡参与ALI发生的机制之一。NETosis是由中性粒细胞外陷阱(neutrophilextracellulartraps,NETs)激活的新型程序性细胞死亡方式,烟酰胺腺噤吟二核苜磷酸酶(nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NA
3、DPH)氧化酶介导的活性氧(reactiveoxygenspecieszROS)累积、细胞自噬、颗粒酶的释放和转运等均被证实参与ALI/ARDS的发生。目前铁丝网、坏死性凋亡、NETosis3种程序性细胞死亡方式均在动物实验中被证实参与ALl的发生、发展。因此对铁死亡、坏死性凋亡和NETosis的研究有助于进一步理解ALI/ARDS的发病机制，有望为临床高危患者的治疗提供理论依据。1铁死亡与AU/ARDSDixon等于2012年首次报道了铁死亡，这是由erastin或RSL3(1Sz3R)-RSL3触发的新型程序性细胞死亡方式，其特征是脂质过氧化的铁依赖性累积。erastin是铁死亡的激活剂，
4、一方面它通过胱氨酸/谷氨酸反向转运体(SystemXc)阻断细胞对半胱氨酸的摄入,造成谷胱甘肽(glutathione,GSH)耗竭，降低GPX4活性，从而减弱细胞抗脂质氧化的能力；另一方面它与线粒体电压依赖阴离子通道蛋白结合并抑制其活性,导致线粒体释放大量自由基,进而增强细胞过氧化反应。RSL3是GPX4抑制剂其可以直接作用于脂质过氧化核心细胞因子GPX4并抑制其活性，导致胞内过氧化物积累过量。铁死亡的形态特征主要表现为细胞膜完整、细胞体积缩小、线粒体外膜破裂等。铁死亡的机制被认为主要与细胞内铁积累、GSH耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶灭活和脂质过氧化有关。1.1 铁死亡机制铁死亡的调节机制复杂，
5、涉及多种代谢网络和信号通路，包括铁稳态调节、氨基酸代谢和脂质过氧化。铁死亡发生时，转铁蛋白、铁蛋白中的铁以Fe2+的形式蓄积在细胞内，通过芬顿反应或脂氧合酶产生脂质过氧化物，造成DNA.蛋白质及膜脂质的损伤，促进脂质过氧反应发生，损伤细胞膜导致细胞死亡。氨基酸代谢中，通过细胞膜上SystemXC以1：1的比例转运胞外胱氨酸和胞内谷氨酸。胱氨酸通过一系列酶反应生成GSH,还原性GSH具有清除自由基、抗氧化的作用能有效减少ROS的蓄积。GPX4则是维持GSH还原性的关键酶。最后，细胞膜中的多不饱和脂肪酸在富含Fe2+与ROS的条件下，发生脂质过氧化，产生大量脂质过氧化物蓄积在细胞膜上，从而破坏了细
6、胞膜的完整性，最终导致铁死亡。1.2 铁死亡研究在油酸诱导的小鼠ALI模型中，观察到了线粒体萎缩、线粒体膜破裂等具有铁死亡明显特征的形态学改变，并且铁死亡生物标志物环加氧酶2(cyclooxygenase-2zC0X-2)mRNA的表达也为对照组的7倍，这些现象表明油酸诱导的小鼠ALI模型中发生了明显的铁死亡。进一步探讨ALI小鼠模型中铁死亡的机制发现，油酸诱导小鼠ALI模型中GSH和GPX4蛋白均减少，而谷胱甘肽的消耗和GPX4的减少会导致铁死亡。当GSH和GPX4水平降低时，脂质过氧化可能加剧，因为GSH在GPX4催化下是丙二醛的清除剂。此外，Fe2+通过芬顿反应促进超氧自由基的产生，可能
7、导致脂质过氧化。进一步研究铁代谢和脂质过氧化发现,油酸知市组织中的Fe2+浓度显著升高，铁蛋白降低。这是因为Fe2+主要储存于铁蛋白中，可通过铁蛋白的降解释放大量的Fe2+于组织中，随后大量的Fe2将促进芬顿反应，产生大量脂质过氧化产物，引发铁死亡。总之，油酸诱导ALI模型中GSH的耗竭、GPX4的减少、Fe2+的过量和脂质过氧化的积累可能导致铁死亡。然而，脂质过氧化导致铁死亡的分子信号通路仍有待进一步研究。在PM2.5诱导ALI/ARDS的模型中，PM2.5因介导铁超载和氧化还原失衡而触发内皮细胞中的铁死亡。核因子-E2相关因子2(nuclearfactor-erythroid2-relat
8、edfactor2lNrf2)已被证明可调节核心基因的表达，这些基因在铁死亡级联反应中可调控脂质过氧化、铁稳态、胱氨酸及GSH代谢。PM2.5处理可以抑制小鼠体内Nrf2向细胞核移位，并降低肺上皮细胞中Nrf2的mRNA和蛋白质表达水平。止匕外，GPX4和溶质载体家族7成员11蛋白质水平显著降低,表明PM2.5触发小鼠细胞的铁死亡。最近研究表明，Nrf2激活剂一方面通过调节溶质载体家族7成员11和血红素氧化酶-1的表达来抑制铁死亡另一方面可减少ROS生成并防止GSH耗竭和脂质过氧化物积累，从而抑制铁死亡。上述结果提示，AU/ARDS的发病机制可能与铁死亡有关，为ALI/ARDS的临床治疗提供了
9、新的理论依据。然而，尚没有临床实验检测铁死亡相关指标与ALI/ARDS严重程度和预后的关系。2坏死性凋亡与ALI/ARDS坏死性凋亡是一种程序性细胞死亡方式。根据传统观念，坏死是一种被动的、不受控制的细胞死亡过程。然而，坏死性凋亡的发现改变了以往的传统观念。其形态学表现为细胞肿胀和破裂，与坏死相似；而又与凋亡类似，均由确定的信号通路控制，所以称之为坏死性凋亡。2.1 坏死性凋亡的机制坏死性凋亡的关键机制与受体相互作用蛋白1(receptor-interactingprotein1zRIP1受体相互作用蛋白3(receptor-interactingprotein3,RIP3)和混合谱系激酶结构
10、域样蛋白(mixedlineagekinasedomain-likeprotein,MLKL)的泛素化或磷酸化有关。在坏死性凋亡的研究中，TNF诱导坏死性凋亡的机制研究最为深入。TNFf与细胞膜上的肿瘤坏死因子受体(tumournecrosisfactorreceptor,TNFR)1结合,激活不同的信号通路，包括NF-BsRIP1独立性凋亡、RIP1依赖性凋亡和坏死性凋亡。激活后，TNF三聚体与TNFRl三聚体结合，随后招募RIPKTNFR相关死亡结构域(TNFreceptor-associateddeathdomain,TRADDTNRF相关因子2和细胞凋亡抑制蛋白。这些成分在质膜上组装复
11、合物I,激活NF-KB信号。随后JRADD和RIP1与TNFR1分离,形成复合物,包括复合物Ha、b和c0从复合物I分离后，TRADD通过死亡结构域蛋白和半胱天冬酶(caspase)-8与Fas相关死亡机构域蛋白(fas-associatedproteinwithdeathdomain；FADD)关联，形成复合物Ha。复合物a形成后，RIP1独立性凋亡的诱导不依赖于RIP1和RIP1激酶活性。在从复合物工过渡到复合物II的过程中，RIP1的C末端死亡结构域发生二聚化。RIP1二聚化对RIP1激活至关重要，并引起复合物工ib(由RIP1、死亡结构域蛋白和caspase-8组成Mnic(由RIP1
12、和RIP3组成)的组装。复合物b在没有TRADD的情况下形成,需要RIP1激酶来激活caspase-8和RIP1依赖性凋亡。复合物IIa和b形成后，通过凋亡激活CaSPaSe依赖性细胞死亡，而复合物c诱导坏死性凋亡。当激活的RIP1与RIP3结合后，诱导复合物IIc（或称为坏死体）的形成，然后细胞死亡以不依赖于caspase的方式调控，引起MLKL的磷酸化和寡聚化，标志着坏死性凋亡的开始。最终寡聚化MLKL易位到细胞膜导致膜破裂，引发坏死性细胞死亡。2.2 坏死性凋亡研究在高氧诱导的ALI/ARDS模型中,长期暴露于高氧环境可导致肺组织损伤，止匕称为高氧性急市损伤（hyperoxia-indu
13、cedacutelunginjury,HALIRIPKRIP3和MLKL的组合是调节坏死性凋亡的3个关键蛋白质。坏死性凋亡抑制剂T（necroptosis。，Nec-1）是一种特异性小分子坏死性凋亡抑制剂，可特异性抑制RIP1激酶活性和RIP1与RIP3相互作用。一般认为，细胞内ROS的增加是AU/ARDS的致病机制之一，同时伴随着宿主的继发性炎症和应激反应。依达拉奉是一种已知的自由基清除剂，雾化吸入依达拉奉对HALI有保护作用。将大鼠暴露于250kPa的纯氧中6h诱发HALIz结果显示,坏死细胞和RIP1、RIP3和MLKL表达增加。Nec-1预处理显著改善了肺损伤情况，表现为肺损伤病理核心
14、表达产物的减少。此外，给予大鼠依达拉奉预处理显著降低了肺和血清中的丙二醛含量，增加了肺中的超氧化物歧化酶活性和GSH含量，同时降低了RIPkRIP3和MLKL的表达，并抑制RIP1和RIP3之间的相互作用。这些研究表明，坏死性凋亡与高氧暴露引起的ALI/ARDS有关，HALI大鼠肺中过度产生的ROS可能激活坏死性凋亡,而Nec-1预处理可抑制坏死性凋亡并减轻肺损伤程度。但是在HALI的发病机制中，哪种细胞死亡方式占主导地位以及坏死性凋亡是否具有细胞特异性尚不清楚。坏死性凋亡在HALI中的作用机制有待进一步研究。在脂多糖(IipopolysacchaHdeJPS)诱导的ALI/ARDS模型中，大
15、鼠肺泡上皮细胞可出现明显的坏死性凋亡，而Nec-1可阻断这种坏死性凋亡。Nrf2/血红素加氧酶T(hemeoxygenase-%H0-1)信号通路在氧化应激中起着至关重要的作用。在稳态条件下，Nrf2以非活性状态储存于细胞质中，然而，一旦细胞发生氧化应激，Nrf2就会转移到细胞核中并与抗氧化反应元件结合，激活下游H0-1表达，从而调节抗氧化相关基因和酶(如超氧化物歧化酶和丙二醛)的表达,并最终发挥其抗氧化功能。H0-1是一种抗ROS基因，在细胞损伤时被激活，Nec-1能增强H0-1的表达，减弱ROS对LPS诱导的ALI/ARDS的反应。因此，ROS生成减少可能被认为是LPS诱导ALI/ARDS
16、导致坏死性凋亡最重要的抑制机制之一。以上研究可能有助于了解细菌感染引起AU/ARDS的具体机制，并为进一步的分子靶向治疗提供新的前景。3NETosisALI/ARDSNEToSiS是一种由NETS激活的独特的细胞死亡类型。NETS是细胞受到损伤和感染时释放到胞外的网状DNA蛋白结合物，其主要成分包括DNA、修饰组蛋白和细胞毒性蛋白质包括中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophilelastase,NE髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO片口组织蛋白酶o正常情况下NETs主要起保护作用，形成网状结构以捕捉微生物。然而，NETs的过度激活被认为是ALI/ARDS.凝血病、多器官衰竭和
17、自身免疫性疾病的致病因素。在LPS诱导的小鼠ALI/ARDS模型中，NETs中的组蛋白诱导肺泡上皮细胞和血管内皮细胞死亡。位于小支气管的DNA链与黏蛋白形成复合物，导致气管局部阻塞，阻塞的气道构成了细菌生长和定植的适宜环境。此外,MPO和NE可降解由葡萄糖胺和己糖醛酸的重复二糖单元组成的糖胺聚糖硫酸乙酰肝素，硫酸乙酰肝素是信号通路的调节器，能使中性粒细胞接触内皮黏附分子，进一步增强炎症反应。中性粒细胞衍生的抗菌肽（如相关抗菌肽LL-37）与MPO及组蛋白联合，对内皮细胞和支气管上皮细胞产生细胞毒性,能引起肺泡和毛细血管损伤，导致AU/ARDS的发生、发展。NE能通过损害上皮细胞肌动蛋白、E钙黏
18、蛋白和VE钙指蛋白，破坏黏膜屏障并增加肺泡毛细血管屏障的通透性。研究发现，NE介导上皮细胞凋亡，并通过PAR、NF-B和p53依赖机制促进炎症介质的释放。炎症介质不仅能够破坏血液/肺泡屏障功能,而且能够促进NETs的形成，引起胞质分裂和原位血栓，导致内皮细胞和肺泡损伤，表现为血液/肺泡屏障通透性增加，富含炎症介质的液体外渗。一旦渗出液积聚在间质和肺泡内，就会导致气体交换功能受损，引起低氧血症，最终发展为急性呼吸衰竭。4展望铁死亡、坏死性凋亡、NETOSiS都与ALI/ARDS密切相关，但目前的研究大多限于动物模型,缺乏临床研究并且程序性细胞死亡方式与ALI/ARDS的关系仍处于初级研究阶段，需进一步研究探索，为有针对性地治疗ALI/ARDS提供干预新靶点和理论新依据。
