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1、血清总胆红素及结合胆红素测定,重氮反应法测定总胆红素和结合胆红素,【实验原理】血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红素须有加速剂咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重氮反应pH6.5，最后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素(吸收峰530nm)转变成蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，使检测灵敏度提高。,【检验原理】总胆红素在pH3.0附近，在钒酸盐和表面活性剂存在下，可以被氧化成胆绿素。与此同时，胆红素特有的黄色也随之消失。测定胆红素氧化前后吸光度的差，可以计算出样品中总胆红素的浓度。,【试剂】1咖啡因-苯甲酸钠试
2、剂 2碱性酒石酸钠溶液 372.5mmol/L亚硝酸钠溶液428.9mmol/L对氨基苯磺酸溶液5重氮试剂 65.0g/L叠氮钠溶液。7胆红素标准液,【操作步骤】1.样品的测定 取3支试管，按下表程序操作.,混匀后，波长600nm，对照管调零，读取吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。,2.标准曲线制作 取5支试管，分别编号，然后按表稀释胆红素储存液配制胆红素标准液。,混匀(不可产生气泡)，按总胆红素测定法操作。每一浓度作3个平行管，并分别做标准对照管，用各自的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此
3、吸光度，然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线,【参考范围】血清总胆红素：5.119mol/L(0.31.1mg/dl)；血清结合胆红素：1.76.8mol/L(0.10.4mg/dl)。【临床意义】1血清总胆红素测定的意义(1)有无黄疸及黄疸程度的鉴别。(2)肝细胞损害程度和预后的判断 胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。(3)新生儿溶血症 血清胆红素有助于了解疾病严重程度。(4)再生障碍性贫血及数种继发性贫血(主要见于癌或慢性肾炎引起)，血清总胆红素减少。,2血清结合胆红素测定的意义 结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别
4、黄疸类型。(1)比值20%溶血性黄疸，阵发性血红蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。(2)比值40%60%肝细胞性黄疸。(3)比值60%阻塞性黄疸。但以上几类黄疸，尤其是(2)、(3)类之间有重叠。,【临床意义】,谁是动名词？,doing,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,【原理】胆红素呈黄色，在450nm附近有最大吸收峰。胆红素氧化酶(BOD)催化胆红素氧化，随着胆红素被氧化，A450nm下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关。在pH8.0条件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，因而检测450nm吸光度的下降值可反映总胆红素含量；加入SDS及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化。在pH3
5、.74.5缓冲液中，BOD催化单葡萄糖醛酸胆红素(mBc)、双葡萄糖醛酸胆红素(dBc)及大部分胆红素氧化，非结合胆红素(Bu)在此pH条件下不被氧化。用配制于人血清中的二牛磺酸胆红素(ditaurobilirubin，DTB)作标准品，检测此条件下450nm吸光度的下降值可反映结合胆红素的含量。,【试剂】10.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2)称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.211g，胆酸钠172.3mg,十二烷基硫酸钠(SDS)432.6mg，溶于去离子水90ml中，在室温(2530)用1mol/L盐酸调节pH至8.2(约用6ml)，再加蒸馏水至100ml，置冰箱保存，此
6、液含4mmol/L胆酸钠、15mmol/L SDS。20.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.5)。3BOD溶液 如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜过长(约可保存1周)，如系液体(可能含有甘油)，置4冰箱可保存较长时间，BOD贮存溶液的酶活性一般在数千至1万2万U/L，BOD工作液酶活性可按反应液中BOD终浓度达0.31.0U/ml计算。4总胆红素标准液(342mol/L)按胆红素测定J-G法中方法配制，或市售合乎要求的标准液。5结合胆红素标准液 将DTB配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中，或用冻干品按说明书要求重建。配制后分装于聚丙烯管内，70保存，可稳定6个月。冻干品未重建前置低温中，至少稳定1年。,【操作步骤】总胆红素和结合胆红素测定分别按表标准管进行。取4支试管，标明标准空白管，测定空白管，标准管和测定管。,加入BOD工作液后立即混匀，置37C水浴5min，用分光光度计，在450nm波长，去离子水调零，读取各管吸光度(A)。用于对照管的比色杯与非对照管的比色杯不得混用。,谢谢,
