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1、用于蛋白质鉴定的两种基本的质谱分析技术,1）MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/基质辅助激光解吸附离子化 Time-Of-Flight mass spectrometry 飞行时间 PMF:peptide mass fingerprinting 肽质量指纹谱 MW:800-300,000,2）SELDI-TOF MS Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization 表面增强激光解吸附离子化 MW:2,000-50,0003）MS/MS Tandem MS串连质谱技术 MW:2
2、00-3,000,1）MALDI-TOF MS（原理示意图）,Source,Length=s,Field-free drift zone,Length=D,Ed=0,Microchannel plate detector,Extraction grid(source voltage-Vs),UV(337 nm),Detector grid-Vs,Pulse voltage,Analyte/matrix,用MALDI-TOF MS和数据库鉴定细菌蛋白GroEL,PMF肽质量指纹谱鉴定蛋白质例子,Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPE
3、TL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG,Myoglobin用胰蛋白酶限制酶切后产生的肽段（从碱性氨基酸的羧基端切断）,Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA II
4、HVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG,胰蛋白酶酶切Myoglobin产生的肽段及其分子量,1811.90 GLSDGEWQQVLNVWGK 1606.85 VEADIAGHGQEVLIR 1271.66 LFTGHPETLEK 1378.83 HGTVVLTALGGILK 1982.05 KGHHEAELKPLAQSHATK 1853.95 GHHEAELKPLAQSHATK 1884.01 YLEFISDAIIHVLHSK 1502.66 HPGDFGADAQGAMTK 748.43 ALELFR,实际质谱分析所得的肽质量指纹谱,GLSD
5、GEWQQVLNVWGK,VEADIAGHGQEVLIR,LFTGHPETLEK,HGTVVLTALGGILK,KGHHEAELKPLAQSHATK,GHHEAELKPLAQSHATK,YLEFISDAIIHVLHSK,HPGDFGADAQGAMTK,ALELFR,2）SELDI-TOF MS（原理示意图）,EAM:能量吸收分子,SELDI-TOF MS分析使用的各种蛋白质芯片,SELDI-TOF MA检测结果与处理,实例：鼻咽癌病人血清标志物检测,卵巢癌细胞培养液上清中分泌蛋白的SELDI-TOF MS检测分析,2）MS/MS串连质谱分析原理示意图,限制酶切蛋白质为肽段,第一步MS分离各个肽
6、段第二步MS对其中的一个肽段进行氨基酸序列分析,MS/MS,碰撞诱导解离CID中多肽分子结构中键断裂的多种可能性,控制CID过程中的能量，使多肽主要从最弱的键-肽键处断裂产生N-端b系列和C-端y系列肽段,-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-,Ri,Ri+1,yn-i-1,bi+1,串联质谱氨基酸序列分析例子肽段SGFLEEDELK在理想条件下可生成的b、y系列离子,S=serine 87.08G=glycine 57.05F=phenylalanine 147.18L=leucine 113.16E=glutamate 129.12D=aspartate 115.09K=lysine
7、 128.17,先找出y系列离子,再找出b系列离子,新序列推测,新序列推测2,新序列推测原则软件辅助分析,找出最佳路径一个峰不能使用两次，连续前进或者退后。简单肽段模式软件辅助分析（上网利用相关网站的软件和数据库）,六、质谱分析技术在医学生物学中的应用1、蛋白质鉴定：用于多肽，蛋白质的分子量测定外，还广泛的应用于肽指纹图谱测定及氨基酸序列测定。1）直接通过末端氨基酸序列分析鉴定蛋白质2）结合肽谱数据库鉴定蛋白质（肽质量指纹谱）3）蛋白质修饰鉴定,用MALDI-TOF MS检测特定部位氨基酸残基的磷酸化,4）分子量测定：MALDI-TOF 的准确度高达0.1%0.01%，远远高于目前常规应用的S
8、DS 电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达300KDa。5）另外分子量测定还可以提供分子结构信息：（1）分子式(样品的元素组成)用同位素丰度比法（低分辨法）或高分辨质谱仪测得的准确相对分子质量，均可以确定分子式；（2）鉴定某些官能团如甲基(m/z 15)、羰基(m/z 28)、甲氧基(m/z 31)、乙酰基(m/z 43)（3）分子结构信息由分子结构与裂解方式的经验规律,根据碎片离子的m/z 及相对丰度RA 提供分子结构信息。,2、质谱峰图谱比较：用于混合物比较 如血、尿、分泌液中的代谢物（大分子和小分子）等改变的监测，可以用于生物标记物分析鉴定，作为生物药材的鉴定，监测疾
9、病过程，治疗效果，预后评价，各种生理病理过程研究的监测和评估3、质谱分析方法的选择 1）质谱峰图谱比较：SELDI-TOF MS 2 kDa 50 kDa MALDI-TOF MS 0.8 kDa 300 kDa 2）蛋白质鉴定：MALDI-TOF MS PMF 串联质谱（MS-MS）氨基酸序列分析,七、基本过程与样品制备注意事项,（一）基本过程1）蛋白质分离纯化：还原和巯基封闭（烷基化）等电聚焦-SDS PAGE电泳（500-10,000个点）混合HPLC层析直接接MS分析（用IEX/RPC方法可以产生2,500洗脱带）对SELDI-TOF MS溶解蛋白质直接加在蛋白质芯片上2）胶染色，图像
10、分析（比较找差异，双染色如Cy3、Cy5染色），含蛋白胶切取（前后图像对照）。以上各个步骤在自己的实验室完成,3）胶内蛋白酶限制酶切，从此步骤可由公司完成4）肽段提取纯化，点样5）质谱分析数据获取（质谱仪器分析）6）数据信息解读 人工：氨基酸序列分析（可以自己人工分析）软件处理：蛋白质鉴定、氨基酸序列分析网站：expasy.org/tools/#proteome 可以选择转向相关网站软件：MASCOT等适用于PMF和氨基酸序列分析数据库：MSDB、NCBInr、SwissProt,（二）样品制备注意事项,1）防止蛋白质降解2）需要还原与烷基化处理3）电泳胶块处理过程中（取胶、染色、切取胶块等）
11、，不可皮肤直接接触，和头皮削掉落其上。4）切胶前后留胶的图像5）送作质谱分析样品达到必须的浓度6）有可带电荷基团、适当的pH值、不含各种去污剂、DMSO、DMF、甘油、磷酸盐、其它盐和缓冲剂 100 mM。,The following ponents are ACCEPTABLE Acetic or formic acid,Acetonitrile,ethanol,Guanidine/HCl 4M,Hexafluoroisopropanol up to 40%,Methanol,Sodium chloride 10 mM,Urea 1M,八、质谱数据分析软件使用（以Mascot为例）,ExPASy Proteomics ToolsMatrix Science主页PMF分析MS/MS分析,
