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1、透射电镜样本的制备,超薄切片制样负染,超薄切片,由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。1957年，英国Huxley发明超薄切片机。,超薄切片制片过程,取材,取材具体方法,将动物麻醉或急性处死，暴露的所需脏器。用锋利剪刀剪下一小块组织，放到滴有预冷固定液的蜡片上。将组织切成细长条，再将其切成小块（1mm3）。将小块移至装有预冷固定液的清洁小瓶内。若组织块带有血液而使小瓶内固定液浑浊，应更换新鲜固定液，然后置于4冰箱内固定。,固定,目的：尽可能完整保存细胞在活体状态时的超微结构细节，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的侵入繁殖而产生
2、腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。同时使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后的冲洗和脱水时溶解和流失。,固定方法,化学固定：浸泡固定，原位固定，灌注固定物理固定：冷冻固定，微波固定，临界点干燥固定,灌注固定,通过血液循环的途径将醛类固定液灌流到所要男友定的组织中，待组织适度硬化后，切取所需组织。此法固定迅速而均匀，可同时保存酶的活性和组织超微结构。适用于取材柔软组织或难以浸透、死后变化快的组织和器官，如对中枢神经系统、视网膜和肾脏等组织的固定。,理想固定剂,常用固定剂,固定方法戊二醛-锇酸双固定,先用2.5%戊二醛固定2h以上。缓冲液多次清洗（pH7.4 0.2mol/L磷酸缓冲液洗三次，15
3、min/次）。1%锇酸固定2h。,清洗,组织在固定后，应用清洗液洗去残留的固定液残留的醛可与锇酸反应产物细的电子致密的还原锇。锇酸可与乙醇作用生成沉淀。清洗液采用与固定液同系列的缓冲液。（磷酸缓冲液，二甲砷酸钠缓冲液）,脱水,去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备,常用脱水剂,乙醇，与环氧树脂的互溶性差，需用环氧丙烷作为 中间溶剂进行转换。丙酮,市售的无水丙酮含少量水分，可加入无水硫酸钠或硫酸铜等干燥剂吸去水分。,脱水,浸透和包埋,通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂，使其渗透到组织细胞中去以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时
4、的各种力的作用，有利于超薄切片。,理想包埋剂,Epon812：环氧树脂包埋剂。淡黄色液体，黏度较低，易渗入组织，对细胞结构保存好，在配制时需充分搅拌。聚合后成为具有稳定三维空间结构的固体。,包埋剂配方,包埋板,切片,修块切片,超薄切片机,机械推进式：通过微动螺悬及微动杠杆使标本臂向刀刃作微小推进。热胀冷缩式推进：利用机内金属杆在加热或冷却的微小变化来推进。,判断切片厚度：利用切片反射的光和从切片下水面反射光发生干涉，不同厚度切片在显微镜下呈现不同的干涉色，干涉色与切厚度的关系是：,Formvar膜制备,Formvar（PVF）溶于纯二氯乙烯制成0.2-0.5%的制膜液,染色,组织细胞的成分主要
5、由碳、氢、氧、氮等低原子序数的元素组成，不能形成足够的反差。利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细胞结构对电子产生不同散射程 度以增强反差。,染色剂,30min左右,与CO2接触会形成不溶性碳酸铅沉淀10min左右,半薄切片制作,可进行定位，克服超薄切片盲目性，提高电镜观察的效果。修块时，将切片修得大一些，切成1m的厚片，甲苯胺蓝染色观察。,超薄切片制样程序,取材：处死实验动物后半分钟到1分钟内，最多15分钟取出1mm3的组织块固定：,脱水：,浸透：,包埋：,超薄切片：包埋块修整成四边光滑尖端呈梯形面的锥体，切成50-70nm的超薄切片。切片染色：,负染,阴性染色，是相对于普通染色
6、（称正染色）而言。首先由hall在1955年提出。Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的空洞被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)包埋低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像透明地光亮。两者之间的反差正好相反，故称为负染色,负染,简单快速可显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小及表面结构的特征。病毒,负染染色剂的条件,较强的电子散射能力以产生足够的图像反差
7、。熔点高，在电子束的轰击下不会升华溶解度大，不易析出沉淀。在电镜下不呈现可观察到的结构。分子小，容易渗入不规则表的凹陷处与样品不起化学反应。目前常用的负染液：磷钨酸，磷钨酸钾，磷钨酸钠。磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成13的溶液，使用时应用1 molL氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.47.0或实验所需的值。,样品要求,样品要适当提纯。不要求样品悬液的纯度很高，但杂质过多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类及各种盐类结晶的存在会干扰染色反应和电镜的观察。样品悬液浓度适中，太稀不易找到样品，太浓样品堆积影响观察。,负染染色方法,悬滴法：悬滴法 用一根细滴吸管吸一滴
8、样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染。滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色12分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗12次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察。,喷雾法：将染色液和悬液样品等量混合，用特制的喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察。喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故此法不常用。,漂浮法：先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在负染色液的液滴上漂浮。在漂浮期间，样品和染色液被吸附在铜网的支持膜上，漂浮时间与悬滴法相近。,复习题,简述超薄切片制样步骤负染,
