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1、免疫学技术及应用,第一节 抗原或抗体的检测,抗原和相应抗体，无论在体内或体外相遇，均可发生各种各样的反应，统称为抗原抗体反应。抗原-抗体反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。抗原-抗体反应可 用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。,抗原抗体反应的规律和特点,抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。1、特异性：一种抗原只能和由它刺激产生的抗体相结合，不能跟与它无关的抗体发生反应。这
2、种特性是由抗原的决定簇基于抗体可变的的化学组成、空间立体构型所决定的。2、定比性：抗原一般都是多价的，而抗体（IgG）则是二价的，只有二者比例适合时，抗原抗体才能结合得最充分，形成的抗原抗体复合物最多，反应最明显，结果出现最快，此称为等价带。,3、可逆性：抗原与抗体的结合虽具有稳定性，但由于二者之间是非共价键结合，因此又是可逆的，在一定条件下可解离，且解离后各自生物活性不变。4、分阶段反应：第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二为可见反应阶段，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。5、敏感性：不仅可用于定性，还可用于检测极微量的抗原抗体，其
3、灵敏程度大大超过当前应用的常规化学方法。,抗原抗体比例对反应现象的影响,抗原抗体的检测方法,凝集反应沉淀反应补体溶血反应 和补体结合反应中和反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应,凝集反应(Agglutination),细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集 现象，称为凝集反应。1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。,血 球 凝 集,沉淀反应（Precipitation),血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现
4、沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。,单向免疫扩散(Single Immunodiffusion),是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量。,含抗体的凝胶,沉淀环,双向免疫扩散（Double Immunodiffusion),位于凝胶不同小孔中的抗原和抗体，当两者相对扩散时，经一定时间后，若两者相对应，会在
5、琼脂小孔间、两者最恰当的比例处形成白色沉淀线。观察沉淀线的位置、数量、形状以及对比各沉淀线之间的关系，可对抗原或抗体进行定性分析。此方法可应用于以下方面：（1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行初步估算。（2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗体）（3）抗原或抗体相对分子量的估计双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排孔型、梅花孔型,双向免疫扩散,双向免疫琼脂扩散孔型,三孔型,双孔型,梅花孔型,双排孔型,是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或
6、抗体的定性、组成和两种抗原相关性分析的检测。,免疫电泳（Immunoelectrophoresis),免疫电泳为区带电泳与双向免疫扩散的结合。先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂内分离，然后在与电泳方向平行的方向上开槽，加入抗血清。37下使两者扩散，各区带蛋白在相应的位置与抗体反应形成弧形沉淀线。,火箭电泳（Rocket Electrophoresis),火箭电泳也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀
7、标本中抗原的含量。,火箭电泳示意图,双向免疫电泳（two dimentional immuno-electrophoresis）,是一种将火箭电泳与血清免疫电泳相结合的方法。先将血清用电泳分离出各成分，然后切下凝胶板转移至另一已加有抗血清的凝胶上，进入垂直方向的第二次电泳，形成呈连续火箭样的沉淀线。,补体结合反应（Complement Fixation,CFT),补体结合试验是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素（红细胞的特异性抗体）是否发生溶血反应作指示的一种高灵敏度的抗原与抗体结合反应。该方法敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。,免疫标记技术,用荧
8、光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。,免疫荧光显微技术(Immunofluorescence Technique),是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，FITC)与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。,直接荧光
9、法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。该法的优点是特异性强，但其缺点是每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。补体结合免疫荧光法：此法是在间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体，使之与抗原抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗C3抗体进行示踪。,间接免疫荧光法示意图,酶免疫测定(Enzyme Immunoassay,EIA),是用酶（常用的有辣根过氧化物酶，HRP和碱性磷酸酶，AP)标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与
10、酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织中或细胞表面的抗原。,酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA),是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法BAS-ELISA等。,ELISA,放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA),是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异
11、性结合，使检测的敏感性达ng水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。,放射免疫测定法(RIA)示意图,RIA法原理及标准曲线,75,50,30,10,0,1,10,100,1000,未标记抗原浓度（ng/ml),结合/未结合的放射活性（%）,免疫印迹法(Immunoblotting),是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒 如HIV 的抗体或抗原。,免 疫 印 迹 法 示 意 图,免疫电镜技术（immuno-electron microscopy,IEM）,免疫电镜技术是一种采用电子致密物质标记的抗体与其相应抗原发生特异性结合后，借电镜检出这一标记复合物的技术。是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。,
