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1、临床免疫学检验,免疫学检验的常用技术,免疫学检验的常用技术,免疫比浊技术生物素与链酶亲和素的应用技术金标记酶免分析技术免疫电泳技术抗体提取纯化技术放射免疫分析技术免疫荧光测定技术酶联免疫吸附试验化学发光免疫分析技术免疫印迹技术流式细胞术,金标记酶免分析技术,金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，利用硝酸纤维素（NC）膜等为固相载体，使金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。,金标记酶免分析技术,原理：将滤金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金
2、黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）或抗体，用于免疫印迹、免疫渗滤、免疫层析试验。金标记免疫层析是利用NC膜条状纤维的毛细管作用，是样品在泳动中与金标记物及包被在NC膜上的抗原或抗体结合，出现呈色的阳性信号。,酶免疫技术,酶和酶作用的底物：1.辣根过氧化物酶（HRP）,常用底物为邻苯二胺(OPD)，四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。2.碱性磷酸酶(AP)，多采用对硝基苯磷酸酯为底物。3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、-半乳糖苷酶和脲酶等。,酶联免疫吸附试验,原理：酶联免疫吸附技术是免疫酶技术中固相酶免疫测定的一种技术。基本原理是将待测抗原或抗体先固定于固相载体表面，再用酶标记的抗原或抗体与已被固定的相应抗
3、体或抗原发生特异性反应，加入酶底物及色原后呈色，呈色程度用吸光度（A）值表示，所测A值与待测抗体或抗原的水平呈相关关系。,酶联免疫吸附试验,1.间接法：用于检测样本中特异性抗体将已知特异性抗原包被于聚苯乙烯板微孔，形成固相抗原；洗弃未结合的抗原；加待检样本，若其中含有特异性抗体则与固相抗原结合形成抗原-抗体复合物；洗弃未反应的部分，加酶标记抗抗体（一般为标记抗人IgG或葡萄球菌A蛋白），使在固相载体上形成抗原-待检抗体-标记抗体复合物；洗弃未反应的部分，加入酶底物及色原呈色，在一定波长下测吸光度（A）值判定待测抗体的有无和水平。,酶联免疫吸附试验,2.竞争法：用于检测待检样本中未知抗原或抗体。
4、测定抗原（抗体）时用已知抗体（抗原）包被固相载体，然后同步加入含有待测抗原（抗体）的样本和酶标记抗原（抗体），使待测抗原（抗体）与酶标记抗原（抗体）竞争结合在固相载体上的抗体（抗原）；洗板；加酶底物及色原呈色。待测溶液抗原（抗体）量越多，则被结合的酶标记抗原（抗体）量越少，呈色越浅。呈色深浅与待测抗原（抗体）的量成反比。,酶联免疫吸附试验,3.双抗体或双抗原夹心法：双抗体夹心法：用于检测相对分子质量较大的蛋白质抗原先将已知特异性抗体包被于固相载体上，加待测样本，若其中有相应的抗原则与固相抗体特异性结合；洗板后加入酶标记特异性抗体，使在固相载体上形成包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物；洗板；加
5、酶底物及色原呈色。抗原或抗体水平与所测吸光度（A）值呈正相关。双抗原夹心法：用包被抗原和酶标记抗原检测样本中的特异性抗体。,酶联免疫吸附试验,4.捕获法5.生物素与亲和素ELISA(ABC-ELISA),酶联免疫吸附试验试剂组成,1.标记用酶：最常用辣根过氧化物酶（HRP）标记各种抗体、抗原或亲和素2.酶底物与色原：HRP的底物是H2O2（或过氧化脲）；HRP可用的色原很多，常用的为邻苯二胺（OPD），3，3，5，5，-四甲基联苯硫酸盐（TMBS）等。,传染病的免疫学检查,1.甲型病毒性肝炎（HAV）2.乙型病毒性肝炎(HBV)3.丙型病毒性肝炎(HCV)4.抗人类免疫缺陷病毒（HIV）5.梅
6、毒血清学检测（TP）6.丁型肝炎(HDV),甲型病毒性肝炎（HAV）,HAV属小RNA病毒，为正单链RNA病毒。HAV主要经粪-口途径传播。潜伏期平均28天。HAV抵抗力较强，60加热10-12h后仍具有感染性，85 加热立即灭活，对乙醚、氯仿及PH为3的酸性环境有抵抗力。,甲型病毒性肝炎（HAV）,诊断甲型肝炎的特异性血清学指标是抗HAV的IgM类抗体和IgG类抗体。人感染HAV后，血液中首先出现抗HAV-IgM,与发病后23周达高峰，因此抗HAV-IgM是公认的早期诊断甲型肝炎的指标。抗HAV-IgG一般在急性感染后6个月达高峰，然后逐渐下降，但维持时间较长，可终身存在。因此抗HAV-Ig
7、G可作为人群HAV既往感染的检测指标。,乙型病毒性肝炎,生物学性状：HBV属于嗜肝DNA病毒科。为双链环状DNA。完整的HBV病毒称为Dane颗粒，球形，有包膜(即HBSAg)。HBV有三种颗粒：大球形颗粒，具有感染性的完整颗粒，又称Dane颗粒；小球形颗粒，无传染性；管形颗粒，不含病毒核酸由小球形颗粒串联而成。,乙型病毒性肝炎,HBV抗原包括：表面抗原（HBSAg），是HBV的衣壳蛋白，是HBV感染的主要标志，具有抗原性，可刺激机体产生抗HBS。抗HBS可中和HBV，是一种保护性抗体。核心抗原（HBCAg），是病毒的核衣壳成分，被HBSAg包被，因此在感染者血中不易检出。HBCAg可刺激机体
8、产生抗HBC抗体。e抗原（HBeAg），是HBV核心的可溶性抗原，HBeAg阳性表示病毒在体内复制，传染性较强。HBeAg可刺激机体产生抗HBe 抗体，此抗体对HBV感染具有保护作用。,乙型病毒性肝炎,HBV对低温、干燥、紫外线、70%乙醇均有耐受性。煮沸10010min、高压蒸汽灭菌121 15min或干热160 2h均可灭活HBV。510g/L次氯酸钠30min，0.5%过氧乙酸15min均可破坏其传染性。急性和慢性乙型肝炎病人及血液HBSAg阳性无症状的携带者是HBV的主要传染源。可经血液、唾液、精液和阴道分泌物等传播。HBV主要经血液、血制品、性接触、日常生活接触和母婴垂直传播。,乙型
9、病毒性肝炎,目前检测的HBV特意血清标志物主要有HBSAg、HBSAb、HBeAg、HBeAb、抗HBC-IgM和抗HBC-IgG，常用检测方法为ELISA法，金标记免疫层析法和化学发光法。,乙型病毒性肝炎测定原理,1.HBSAg测定原理：采用双抗体夹心法。将纯化的抗HBS包被固相载体，加入待测样品，若其中含有HBSAg,则与载体上的抗HBS结合，再加入HRP标记的抗HBS抗体，加酶底物及色原呈色.呈色程度与HBSAg含量成正比。2.HBSAb测定原理：采用双抗原夹心法。3.HBeAg测定原理：双抗体夹心法4.HBeAb、HBCAb测定原理：竞争法,HBV血清学标志物的临床意义,丙型病毒性肝炎
10、(HCV),HCV是单正链RNA病毒，呈球形颗粒状，主要在干细胞内进行复制。HCV对氯仿、乙醚等有机溶剂敏感，煮沸、紫外线照射及甲醛处理均可使其灭活。HCV主要经血和血制品传播。急性和慢性丙型肝炎病人及HCV无症状携带者为HCV的主要传染源。而ALT不正常者，为主要传染源。HCV感染的特异性血清学标志是抗HCV抗体，常用方法为ELISA,此为筛查方法。所测主要为抗HCV-IgG。重组免疫印迹试验（RIBA）为确诊试验。,丙型病毒性肝炎检测原理,为间接ELISA法。包被抗原为HCV的基因工程抗原和人工合成多肽抗原的最佳比例组合物（含HCV的核心蛋白、NS3、NS4和NS5蛋白）。待测血清中如有抗
11、HCV，将与包被抗原结合，待加入酶结合物（HRP-抗人IgG）和酶底物及色原溶液后即可产生呈色反应。,丙型病毒性肝炎(HCV)临床意义,HCV是输血后肝炎和散发性非甲非乙型肝炎的主要病原。HCV感染后可导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等多种肝脏疾病。抗HCV阳性而血清中没有HCV RNA提示既往感染。,抗人类免疫缺陷病毒（HIV）,HIV属于逆转录病毒科慢病毒属，分两型，引起全球艾滋病流行的为HIV-1型，流行局限于西部非洲的艾滋病病原为HIV-2型。HIV主要结构蛋白的基因至少有3个：gag基因，编码病毒衣壳蛋白p24;pol基因，编码逆转录酶(p66)与整合酶(p31);env基因，编码包膜
12、糖蛋白前体gp160,在蛋白酶作用下gp160裂解成gp120和gp41。,艾滋病临床分期,1.急性感染期2.无症状感染期(潜伏期)3.艾滋病相关综合征4.艾滋病,HIV传播途径,1.血液传播2.性接触传播3.母婴垂直传播,HIV的抵抗力,HIV对酸性环境、消毒剂和去垢剂等敏感，病毒在PH2环境下失活，50%70%乙醇、2%甲醛、5%石碳酸、0.1%戊二醛、5g/L次氯酸钠等均可灭活HIV。但该病毒对碱性环境（PH9.0左右），紫外线较为耐受。,抗人类免疫缺陷病毒（HIV）,HIV实验室分为初筛实验室和确认实验室。HIV初筛方法常用：ELISA、免疫荧光法、胶乳颗粒凝集法、金标记免疫渗滤法等H
13、IV确认试验：免疫印迹法（WB）,ELISA法检测HIV抗体,原理：采用间接ELISA或双抗原夹心ELISA法。用基因工程或人工合成的HIV-1和HIV-2多肽抗原合理地组合包被反应板微孔，若待测血清中存在HIV抗体时，则与固相抗原结合，洗去未反应物，再加酶标记的抗人IgG（双抗原夹心法采用的是酶标记HIV多肽抗原组合）是酶底物及色原显色。呈色程度与待测HIV抗体水平成正比。,ELISA法检测HIV抗体,试剂：筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批检合格，临床评估质量优良，在有效期内的试剂。结果判定：按试剂盒内临界值计算公式计算，高于临界值为阳性。初筛阳性反应的标本需用原有试剂加上
14、另外一种不同原理不同厂家的试剂复测。如两种试剂均为阴性，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室确认。再经确认实验室确认前，初筛实验室不得发布HIV阳性报告。可出具“HIV抗体待复检”报告。,ELISA法检测HIV抗体临床意义,HIV抗体阳性提示如下：1.感染了HIV，可作为传染源将HIV传播他人。2.抗HIV阳性者（除外18个月的婴儿），5年之内将有10%30%的人发展为艾滋病。3.对HIV抗体阳性的母亲所生的婴儿，如18个月内检测HIV抗体阳性，不能诊断为HIV抗体感染，尚需用HIV核酸检测或18个月后的血清抗体检测来判断。HIV抗体不确定提示：建议病人在报告
15、后3个月后重新复查，如复查阴性，则未被感染。如复查阳性可判断感染HIV。,免疫印迹法测定HIV抗体,结果判定：HIV抗体阳性有下列任何一项阳性即可确认：1.至少有两条env带（gp41、gp160和gp120）出现。2.至少有一条env带和p24同时出现。HIV抗体阴性：无HIV抗体特异带出现HIV抗体不确定：出现HIV抗体特异带，但不足以判定阳性。,免疫印迹法测定HIV抗体,抗原检测：P24抗原抗体检测：P24和P55的抗体出现最早，随后出现gp120和gp160的抗体。这些被认为是初期感染最稳定的指标。,梅 毒,梅毒属于一种性传播疾病，病原体为梅毒螺旋体。梅毒螺旋体为密螺旋体，在体外不易生
16、存，煮沸、干燥、常用的消毒剂均可致其死亡，但对潮湿、寒冷环境的耐受力较强。对青霉素、四环素、红霉素、庆大霉素均敏感。,梅毒的传播途径,梅毒螺旋体主要通过性接触传染，接吻、手术、哺乳、输血、接触污染物也可被传染。患梅毒的孕妇可通过胎盘感染胎儿，早期可致胎儿流产、早产，晚期感染的成活胎儿可患先天梅毒。,梅毒的临床分期,第一期：硬兴下疳，极易传播感染。第二期：梅毒疹期，全身皮肤粘膜出现皮疹。第一、二期称早期梅毒，传染性强、破坏性较小。第三期：梅毒，即梅毒晚期。病损部位螺旋体少但破坏性大。,梅毒血清学试验,1.非特异性类脂质抗原试验：试验使用的抗原从牛心中提取的心磷脂、胆固醇和纯化的磷脂酰胆碱（卵磷脂
17、）组成，即类脂质抗原，测定患者血清中的反应素(即抗脂质抗体)。用于梅毒的筛查。方法主要有：性病研究实验室试验（VDRL）快速血浆反应素试验(RPR):半定量评价疗效和判断有无再感染。不加热血清反应素试验(USR)甲苯胺红不加热血清试验(TRUST),梅毒血清学试验,2.梅毒螺旋体抗原试验：使用的抗原是梅毒螺旋体的特异成分。此类试验有多种，如梅毒螺旋体血凝试验(TPHA),甲苯胺红不加热血清试验(TRUST),原理：试剂中的心磷脂作为抗原与抗体发生反应，卵磷脂可加强心磷脂的抗原性，胆固醇可增强抗体的敏感性。这些成分溶于无水乙醇中，再加入水后胆固醇析出形成载体，心磷脂和卵磷脂在水中形成胶体状包裹在
18、其周围，形成胶体颗粒。将此抗原微粒悬浮于甲苯胺红溶液中，加入待测血清，血清中的抗体与之反应后，可出现肉眼可见的凝集块。,甲苯胺红不加热血清试验(TRUST),结果判定：阴性：呈粉红色均匀分散沉淀物阳性：出现粉红色凝集块，根据凝集块大小记录1+4+阳性反应若需定量检测，可将待测血清用生理盐水倍比稀释后，按定性方法进行。,ELISA法测定梅毒螺旋体(TP)抗体,原理：采用双抗原夹心法将高纯度TP特异抗原包被于微孔板条，待测血清中如存在TP抗体，即可与之结合。再加入酶标记的高纯度TP抗原，在固相上形成TP抗原-抗TP抗体-酶标记TP抗原夹心复合物，待加入酶底物及色原时即产生呈色反应，呈色强度与TP抗体水平成正比。参考区间：正常人血清TP抗体阴性,密螺旋体颗粒凝集试验(TPPA),原理：将梅毒螺旋体Nichols株的精制菌体成分包被于明胶颗粒上，此种致敏颗粒与待检样本中的TP抗体结合时可产生凝集反应。,梅毒抗体检测的临床意义,1.TRUST适用于筛查和治疗效果的监测，梅毒螺旋体抗原试验(ELISA、TPPA、金标记免疫层析等)，对潜伏期和晚期梅毒敏感性更高。2.梅毒的血清学试验阳性，只提示所测标本中有抗类脂抗体或抗TP抗体存在，不能作为患者感染梅毒的绝对依据，阴性结果也不能排除梅毒螺旋体感染，检测结果应结合临床综合分析。3.最好每次用两种以上方法检测。,
