《生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析.ppt（17页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、,酵母RNA的分离、组分鉴定 及含量测定,1、掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。2、了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。3、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。,实验目的,为何选用酵母为材料提取RNA?酵母核酸中主要是RNA(2.67-10.0%），DNA含量很少，且菌体易收集，RNA易分离。从酵母中提取RNA常用方法稀碱法:利用稀碱使细胞壁溶解,时间短，但RNA易分解。浓盐法:加热条件下，利用高浓度盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，产品色泽较好。本实验用0.2%NaOH 使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA。,1.核酸分离,原
2、理,酶促水解化学水解:酸水解:碱基、核糖/脱氧核糖和磷酸 碱水解:RNA存在2-OH，磷酸二酯键不稳定，得单核苷酸,核酸水解方法,2.组分鉴定,RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶碱和磷酸组成，提取得的 RNA 中加10%硫酸煮沸即可得到这些组分的混合溶液（$），分别进行定性鉴定，以证明提取物是否为核酸。,原理,磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀(1mL$+1mL定磷试剂)：(NH4)2MoO4+H3PO4(NH4)3PO412MoO3(黄色)Mo6+SnCL2 Mo4+Mo(MoO4)2(兰色),嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物(1mL$+过量氨水+1mL 0.1M的AgNO3)。,核
3、糖与地衣酚(orcin)试剂反应呈鲜绿色(1mL$+1mL FeCl3+2mL orcin水浴加热),3.RNA含量测定,核酸（DNA和RNA）碱基的苯环结构在紫外区有较强吸收，吸收高峰在260nm波长处，蛋白质则在280nm波长处。当OD2601时，dsDNA浓度约为50g/ml ssDNA浓度约为37g/ml RNA浓度约为40g/ml纯DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7时表明有蛋白质或酚污染,可以增加酚/氯仿抽提）,OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260
4、/OD230估计去盐的程度。对于RNA纯制品，其OD260/OD2802.0，OD260/OD230应大于2。OD260/OD2302说明去盐不充分,可以再次沉淀和70%乙醇洗涤。浓度计算：DNA样品的浓度（g/l）:OD260稀释倍数50/1000RNA样品的浓度（g/l）：OD260稀释倍数40/1000,1提取称取干酵母粉0.4g，放入试管中，加入0.2%NaOH 3mL，然后放入沸水浴中提取15min。2分离用自来水冷却,滴加1-4滴醋酸，调pH至6.0（沉淀蛋白质），装入离心管配平，3000r/min离心3min，（使提取液与菌体残渣分离）。3抽提 收集上清液，加等体积的氯仿，震荡混
5、匀，3500r/min离心5min。4沉淀RNA收集上清，平均分装入两支离心管中，各加2倍体积无水乙醇，边加边搅拌，配平，3500r/min离心5min，得到RNA沉淀。弃去上清液（弃净），一支离心管加5mL蒸馏水回溶，以备浓度测定；另一支离心管加入5mL 10%的 H2SO4,然后转入50mL三角瓶中，待用。,操作步骤,注意配平、对称放置离心管,RNA的酸解将装有待测RNA的三角瓶，在电炉上加热，至溶液透明为止，得到RNA的水解液，期间不停晃动，以使受热均匀。注意RNA加热酸解时，一定注意观察，本步很容易加热过度，使透明溶液变成黑褐色，而导致实验失败。,5.RNA的组分鉴定,.,组分鉴定加蒸
6、馏水将水解液稀释至5mL，然后按下表检验项目所需的量分装三支试管中，进行组分鉴定。,待测样品适当稀释（如量取100L RNA水溶液，加2900L 蒸馏水混匀），用紫外分光光度计分别测定其230nm、260nm 和280nm 的吸光度值。可根据自己的样品浓度调整稀释倍数。黑体透射调零 蒸馏水透射调100 吸收调零,.,6.RNA含量测定,注意保护石英比色皿，轻拿轻放！,配平：含液离心管与外套铁管在一起两组配平（先选两个外套铁管重量接近）对称放于离心机的铁套中。设置：闭盖，选离心机设置键（“亮点”在转速和时间的选择上：可通过三角符号移位，然后再增减），设置数都完成后再按确认键。启动：使“亮点”回到测定位置，按启动键。转动期间盖子打不开。若声音很大异常。立即按停止键。,离心机的使用,通过实验现象说明鉴定的结果，由结果进一步说明你的提取物是什么？计算RNA溶液浓度及酵母RNA得率，并判断样品纯度。将组分定性鉴定实验结果交老师过目评分，然后清洗离心管，整理实验台，用具归位，试剂瓶从高到低排列。,结果与分析,1、以酵母为材料提取RNA有什么优点？2、如何对核酸水解组分进行鉴定？3、利用紫外分光光度法如何判断核酸样品的纯度。,思考题,
