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1、(一)、纸电泳的原理、操作及其应用(二)、醋酸纤维薄膜电泳：原理特点应用：血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳电泳图谱 异常及其原因 注意事项,纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳,制作小组成员：（916号）李敏、周瑞、肖阳、王超、陆瑶、谭茹瑜、刘倩、刘忠志,纸电泳,纸电泳是根据电泳现象在渗透了缓冲液的滤纸加上电场使物质移动的电泳法。（也就是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。）常用以分离性质相似的物质，如各种氨基酸的分离和稀土元素的分离等。,纸电泳原理,纸电泳是利用纸作为支持物，使带电微粒在纸上电泳，从而达到分离的一种方法。将样品点在用缓冲液浸湿的滤纸上，将滤纸放在电泳槽的支架上，滤纸的
2、两端浸在缓冲溶液里，接通电源，纸的两端就有一定的电压，吸引带电颗粒在纸上移动。氨基酸在其等电点时以兼性离子存在，若溶液的pH低于氨基酸的等电点（pHpI），则氨基酸分子带有正电荷（Aa+），电泳时向负极移动；若溶液的pH高于等电点（pHpI），氨基酸分子带有负电荷（Aa-）,电泳时向正极移动。电泳过程中，由于电极反应会使连接正极和负极的电解液的pH向相反方向变化，所以应用缓冲溶液以保持pH相对稳定。另外，选用挥发性的缓冲溶液较好，因为电泳后滤纸烘干时容易除去，以减少对显色的影响。,纸电泳操作要点,1、选择缓冲液对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响 A:分离蛋白质，pI 5，选pH8.6的
3、缓冲液（巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4)B:分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸醋酸，pH5.9 C:分离核苷酸巴比妥醋酸pH2.5，柠檬酸pH23 D:分离糖类：HAC-NaAC,pH35,2、滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽23cm/样品组分，长短影响 电场强度。3、点样 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知 样品）、点一边（已知样品）干法、湿法4、电泳 电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间5、显色及分析 蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B Aa：茚三酮、靛红 核酸：紫外光下观察 一般洗脱定量,纸电泳的操作注意事项,1点样应在滤纸的一端距纸边cm处。样品可点
4、成圆形或长条形，长条形的分离效果较好。点样量为微克和微升。点样方法有干点法和湿点法。（湿点法是在点样前将滤纸用缓冲液浸湿，样品液要求较浓，不亦多次点样。干点法是在点样后再用缓冲液和喷雾器将滤纸喷湿，点样时可用吹风机吹干后多次点样，因而可以用较稀的样品。）2严禁空载，空载易造成电泳仪损坏，只有高级双稳（能控制电流强度和电压）电泳仪才提供空载保护。3电泳完毕后，应先关闭电源，再拔小插头，以免触电。在仪器接通电源工作期间，严禁接触电泳槽电极、电极插头和电泳物等，严禁输出电极与地短路，以免破坏仪器。仪器不许空载运行，防止震动，使用环境应保持干燥，应无腐蚀性气体存在。,纸电泳的应用,纸电泳的设备简单，应
5、用广泛，是最早使用的一种电泳技术。最初用于蛋白质，后来也用于氨基酸、核苷酸一些低分子物质，其优点在于或采用滤纸与色素结合的直接电泳图，或剪下滤纸的任何部分来抽提其中的物质。在早期的生物化学研究中，曾发挥重要作用。由于纸电泳时间长，分辨率较差，近年来逐渐为其他快速、简便、分辨率高的电泳技术所代替。,一、醋酸纤维薄膜电泳原理,醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术。醋酸纤维薄膜具有匀一的泡沫状结构（厚约 120 m），渗透性强，对分子移动无阻力，用它做区带电泳的支持物，用样量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广和快速简便,且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄
6、膜便于保存和定量分析。,二、醋酸纤维薄膜电泳特点,1、（1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。（2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳4560min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。,（3）灵敏度高，样品用量少。血清蛋白仅需2l血清，甚至加样体积少至0.1l，仅含5g蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。（4）应用面广
7、。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。（5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。2、醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出56条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。,三、醋酸纤维薄膜电泳的应用：,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,实验原理泳动度影响泳动度的因素器材与试剂操作方法,醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎
8、蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中。,实验原理,任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。如氨基酸、蛋白质、酶、核酸等及其衍生物质都具有许多可解离的酸性或碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。,一般在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。,泳动度,不同质点在同一电场中的泳动速度不同，常用泳动度或迁移率来表示。泳动度指带电质点在单位电场强度下的泳动速度。v d/t dl u=（cm2.V-1.S-1)E V
9、/l Vt,影响泳动度因素,1.带电质点的性质 质点所带净电荷的量、质点的大小及质点的形状。一般说来质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近球形，则在电场中的泳动速度越快；反之则越慢。,2、溶液的粘度3、电场强度4、溶液的pH值5、溶液的离子强度6、固体支持物的电渗现象,器材与试剂：,粗滤纸电泳槽巴比妥缓冲液染色液漂洗液透明液,醋酸纤维薄膜 常压电泳仪点样器培养皿玻璃板,1、薄膜准备：用镊子取醋酸薄膜一张，放在绥冲液中浸泡20分钟。（识别光泽面与无光泽面，并在有光泽面一角做记号）2、制造滤纸桥：剪取双层合适尺寸滤纸桥附在电泳槽支架上，使其一端与支架的前沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液中，用缓冲
10、液润湿并驱赶气泡，使滤纸紧贴在支架上。如图,操作方法：,3、点样：取出膜条，用双层滤纸吸干多余的液体，平铺在玻璃板上，无光泽面朝上，用点样器蘸取血清在膜条的一端1.5cm处，均匀划一条线。4、电泳：在两电极槽内加入等高的缓冲液，将膜条平悬于滤纸桥上（点样端靠近负极），盖严电泳室通电，电压120V，电流0.4-0.7mA/cm 膜宽，电泳60分钟。,5、染色：电泳完毕后，取膜条放在染色液中浸泡10分钟左右。6、漂洗：漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的图谱。保存。7、透明：将干燥的电泳图谱放入透明液中浸泡2-3分钟后取出贴于洁净的玻璃板上，干后放在两层滤纸中保存。8、计算：计算出每条蛋
11、白的泳动度。,四、电泳图谱 异常及其原因,电泳图谱不齐或分离不良 电泳图谱出现条痕区带拖尾或区带过于紧密区带一边长一边短呈现扭曲现象5 球蛋白区带倒退染色后白蛋白中间色浅染色后区带清晰度不良白蛋白区带染色不均并有空泡透明时膜发白不能完全透明透明时膜溶解,1、电泳图谱不齐或分离不良 这是电泳分析中最常见的问题，多数是由于血清滴加不均匀或滴加过多，也有因薄膜质量不合要求所致。点样这一步非常关键，一定要按操作步骤进行。首先选择质匀、孔细、染料吸附少的薄膜充分浸透缓冲液至湿度均匀无干白点。然后将滤纸吸去薄膜表面的多余水份，使薄膜含水量饱和均匀，这样才能防止薄膜表面液体含量不均，水份移动而引起标本移位。
12、点样前注意关闭门窗和风扇，因空气流通快可使标本和水份蒸发而影响电泳图形。点样要力求做到均匀迅速，有报道，在实践中把加样器干沾血清，改为沾取标本前先浸入蒸馏水中沾湿用吸水纸吸干后再沾血清，这样加样器内均匀沾取血清的效果较干沾为佳。,2、电泳图谱出现条痕 问题是由于点样后薄膜过干，或因电泳槽密闭性不良，或电流过大，温度升高，薄膜水份蒸发干燥而造成的。因此薄膜一定要充分浸透后才能点样，并注意检查电泳槽是否盖紧，电泳槽要放在远离光源热源的阴凉之处。在电泳过程中随时观察电压电流的变化，因通电后产生一定的热量，电流会有所增加。控制电压100110V，电流0.50.6mA/cm，电泳时间一般冬长夏短，以区带
13、展开3.54cm即可(另加一条溴酚蓝预染血清，同样操作，指示区带展开的距离)。,3、区带拖尾或区带过于紧密 缓冲液的离子强度低于0.05即出现区带拖尾现象，离子强度0.075则区带过于紧密。此时需要检查更换缓冲液。常规操作一般使用连续电泳巴比妥盐缓冲液pH8.6，离子强度0.06。电泳槽中缓冲液经10次使用后，不应简单地采取交换电极的方法，而是将缓冲液取出重新混合过滤后，再进行使用，一般用4个周期后需更换新液。离子强度愈低，区带展开愈长，电泳速度愈快。电泳区带展开的距离也跟薄膜数量有关。在教学实验中，经常发现薄膜愈少，展开的距离愈短，区带愈清晰的现象。在仪器输出电压相同的情况下，薄膜愈少，加在
14、薄膜两端的电压愈高，电压高会使展开的长度缩短。只要薄膜数量在5条以上，即可使图谱展开长度有较好的重现性。,4、区带一边长一边短呈现扭曲现象 这是薄膜两边电阻不一样，电阻大的一边电流小，速度慢，区带展开短。造成这种现象的原因是薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻。在操作过程中，一定要注意使薄膜两端紧压在滤纸桥上。5、球蛋白区带倒退 这是电渗作用引起的。可升高点样端的缓冲液面高度或适当加大电流量克服之。6、染色后白蛋白中间色浅 有些同学在实验中往往急于求成，染色时间未到便匆忙取出薄膜漂洗，结果造成了白蛋白区带中间色浅的现象。造成这种现象的另一个原因是白蛋白含量过高。可增加染色时
15、间或减少点样量解决之。,7、染色后区带清晰度不良 陈旧标本可使区带分离清晰度大为降低。应尽量当日标本当日做，最多不超过2天。另外标本不可溶血，因溶血标本中血红蛋白与球蛋白的电泳区带相重迭。可造成球蛋白含量升高而蛋白质含量相对减少的结果。8、白蛋白区带染色不均并有空泡 这是染色液陈旧所致，染色液存放和使用过久，会降低蛋白质结合染料的能力。发现正在使用的染液已陈旧时，应立即全部弃去，更换新液。9、透明时膜发白不能完全透明 薄膜未干或透明液中醋酸含量不足可造成膜发白而不能达到透明的目的，应将薄膜晾干，适当增加透明液的醋酸浓度。10、透明时膜溶解 室内温度过高或透明液醋酸浓度过高均可使膜溶解。可采用适当降低透明液醋酸浓度的办法来解决。,五、注意事项,1、醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。2、点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以 防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。3、缓冲溶液离子强度不应小于0.05或大于0.07。因为过小可使区带拖尾，过大则使区带过于紧密。4、电泳槽中缓冲液要保持清洁(数天过滤)两极溶液要交替使用；最好将连接正、负极的线路调换使用。5、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。,
