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1、解放军307医院EGFR突变检测经验分享,刘 毅解放军307医院 全军肿瘤中心 肿瘤学研究室&肺癌分子诊断中心,开展EGFR突变检测面临的问题,一、是什么和为什么二、怎么做及注意事项三、临床问题的解决：转化性研究,一、是什么和为什么,EGFR基因的基本情况,EGFR：表皮生长因子受体,EGFR的胞内信号传导途径,EGFR与肿瘤的生长及酪氨酸激酶抑制剂（TKI）,http:/www.egfr-,EGFR的突变与TKI类药物疗效,19外显子：5-TATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-3,21外显子：5-GGGCTGGCCAAACTG-3,N Engl J Med
2、2004;350:2129-39,EGFR的突变类型,Nature Reviews Cancer 2007;7:169-181,肺癌靶向治疗的里程碑：IPASS研究,肺癌靶向治疗的里程碑：IPASS研究,N Engl J Med 2009;361:947-57,肺癌靶向治疗的里程碑：IPASS研究,EGFR突变状态指导TKI类药物的使用,EGFR突变状态已成为患者能否在一线使用TKI药物的重要指标,二、怎么做及注意事项,目前较为常见的RGFR突变检测方法,http:/www.egfr-,EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念,2、基因突变是指DNA发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段
3、，针对非DNA的检测手段如：RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及针对非碱基序列的检测手段如：FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用。,1、EGFR突变为体细胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。,EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念,3、样品特性：异质性，突变细胞或DNA的含量一般较少，DNA经常会严重片段化4、关键是保证突变DNA有效扩增至可检测的范围：扩增效率及检测方法的敏感性,1、TapMan 探针法：边扩增边检测,优势只检测突变的序列敏感性高且污染
4、几率小不足探针费用较高只能针对已知突变正常DNA的扩增无限制,Nature Reviews Drug Discovery 2004：3,749-761,2、高分辨率溶解曲线（HRM）：扩增后再检测,优势已知和未知突变序列敏感性高且污染几率小不足正常DNA的扩增无限制对仪器设备的要求较高阳性结果还需进一步确认,3、变性高效液相色谱分析（dHPLC）：扩增后再检测,优势敏感性高已知和未知突变序列不足仪器普及率低正常DNA的扩增无限制开盖检测增加污染几率阳性结果还需进一步确认检测环境需独立且通风良好,4、直接测序法：扩增后再检测,优势直观且相对成本低已知和未知突变序列不足工作量大且敏感性低开盖会增加
5、污染几率正常DNA的扩增无限制,Sanger测序法原理,5、焦磷酸测序：扩增后再检测,优势适合已知序列已知和未知突变均可测敏感性高、直观、能够定量不足需要专用仪器正常DNA的扩增无限制开盖会导致污染几率增加,6、突变富集PCR：扩增后再检测（抑制正常DNA扩增）,优势敏感性高（此消彼长）不足操作繁琐只针对已知突变开盖导致污染几率增加不好找合适的限制性内切酶,Clin Cancer Res 2006;12(1):43-48,7、扩增阻滞突变系统（蝎形探针）：边扩增边检测,优势敏感性高且污染几率小只扩增并检测突变的序列不足只针对已知突变试剂盒费用较高,72延伸,94解链,60自身杂交发光,ARMS
6、引物,各种突变检测方法的综合比较,http:/www.egfr-,1、操作流程 2、污染几率3、敏 感 性 4、可实施性,我们最初采用的方法：直接测序法,选择的理由结果直观易懂大量文献支持、金标准实验室条件能够满足要求,注意事项：DNA抽提部分,1、DNA提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性2、尽可能使用认可程度高的试剂，以保证DNA的提取效率（TaKaRa DEXPAT）3、严格按照说明书要求保存试剂（温度、湿度等），以免试剂失效4、可按自身需求对操作流程做适当修改，但要形成SOP操作规范（示例1、2）5、DNA提取区域与DNA扩增后的分析区域要完全分隔，以避免气溶胶
7、污染,注意事项：PCR扩增部分,1、DNA质量控制非常重要，可保证后续实验的顺利进行（模板过量、PCR抑制剂）,2、设置好阴性对照（避免污染）和阳性对照（验证实验体系，必要时可取消）,3、选用保真性较高的Taq酶，避免由实验体系带来的假阳性4、做好详细的实验记录，为以后的各种分析提供依据（示例）,Marker 百倍稀释 原液 空白,Marker 空白 19 21,Marker 空白 19 21,注意事项：PCR扩增部分,注意事项：结果分析部分,报告力求简洁明了，不仅有检测结论还要有可靠的事实依据,注意事项：结果分析部分,检测结果随时归档，以备日后查询、统计,三、临床问题的解决：转化性研究,转化
8、医学,转化医学：以患者为中心，建立临床治疗和基础研究间的双向通道，从临床工作中发现和提出问题，寻找或建立相应的解决方案，然后将其应用于临床，解决临床的实际问题,测序法敏感性不足将导致假阴性结果,F Hirsch,et al.JCO 2006C Zhu,et al.JCO 2008T Mok,et al.Discovery Med 2009,阿斯利康第四期EGFR突变检测培训班,ADx-ARMS：边扩增边检测且保证突变序列的有效扩增,ARMS引物,第一轮扩增64退火保证特异性,第二轮扩增60退火保证扩增效率扩增特异性由一轮引物保证,突变荧光信号：FAM 内控荧光信号：HEX或VIC 外控荧光信号
9、：FAM 阳性对照：内含阳性质粒 阴性对照：蒸馏水内外控均检测EGFR基因2号外显子体系中含特殊石蜡避免气溶胶污染,ADx-ARMS试剂盒的判读流程,是否污染,实验体系,DNA质量,DNA含量,结果判读,参数设置,ADx-AMRS和Dxs ARMS试剂盒的比较,阿斯利康中国创新研究中心与张绪超/吴一龙教授等合作共同完成,测序法和ARMS法的比较,我院已采用ARMS进行检测，提供测序法和ARMS两种方法供临床选择,转化研究的理想模式：临床、实验室及企业间密切协作,肺癌个体化诊断与治疗学术交流（2010年12月28日 307医院)ARMS法检测EGFR突变已在我院临床正式开展，其他转化性研究相继展开,ARMS法的检测报告,报告力求简洁明了，不仅有检测结论还要有可靠的事实依据,焕然一新的实验室,307-青藤转化医学中心 1300m2 肿瘤分子诊断 干细胞再生医学,2010年6月动工，现已竣工并投入使用，仪器设备陆续到位为转化性研究的开展提供了有力的支持,谢谢！,欢迎大家到307医院来参观交流！,
