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1、,生物检测技术,韶关学院生命科学学院易道生Office：英东楼B-301Mp：Email：,内容,主要由六个模块构成：生物化学检测技术免疫学检测技术细胞学检测技术分子生物学检测技术微生物学检测技术生物检测仪器,第一章 生物化学检测技术,内容,第一节电泳技术第二节光谱分析技术第三节生物大分子含量测定第四节色谱分析技术第五节干化学分析技术,目标,掌握琼脂糖电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和操作要点。掌握可见光和紫外光的分光光度技术的原理和方法。理解各种蛋白质含量测定技术的原理和优缺点。理解各种核酸含量测定技术的原理和优缺点。,第一节 电泳检测技术,电泳：带电质点在电场中移动的现象。1809年
2、由俄国人发现。1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法”，成功地分离血清蛋白质各成分。50年代，改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。60年代，找到聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关学科分析中必不可少的手段。,电泳槽和大分子分离结果,电泳技术分类,从实际和实用出发的分类,根据分离样品样品的数量和目的分制备和分析电泳根据结合配套的技术分免疫、层析、
3、等电聚焦、转移、双向、脉冲梯度电场、垂直交替凝胶电泳等根据使用电压分常压（500）和高压电泳。根据电泳系统pH连续与否分连续和不连续pH电泳根据介质使用与否分自由和区带电泳（滤纸、薄层、凝胶电泳）根据电泳槽的形式分有 垂直的、水平的、柱状的、板状的、毛细管的、湿小室及幕状的。毛细管电泳是20世纪80年代研制出的一种新型的区带电泳方法，具有分辨率好、灵敏度高、检测快捷等特点。,自由电泳 可分为：显微电泳（也称细胞电泳），是在显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为；移界电泳；柱电泳；自由流动幕电泳；等速电泳等。支持物电泳 根据支持物的特点又可分为：纸电泳薄层电泳醋酸纤维素薄膜电泳非凝胶性支持物区带电泳(
4、支持物有：淀 粉、纤维素粉、玻璃粉、硅胶等)凝胶区带电泳：淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰 胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳。,2023/5/28,南京农业大学 生命科学学院,11,2023/5/28,南京农业大学 生命科学学院,12,电泳基本原理,电泳是不同的物质颗粒在一定的电场强度下，由于所带电荷及颗粒大小形状等不同，因此向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。,带电颗粒在电场中泳动的
5、速度称迁移率或泳动度。电泳时，带电颗粒（球形）在介质中受力平衡匀速运动，则有：v=F阻/f=FE/f=Eq/f=Eq/(6r)v 泳动度F阻 颗粒所受阻力FE 颗粒所受电场力f 摩擦系数由上式可见：泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷以及电场强度有关。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动度与粒子形状有关。,E 电场强度q 颗粒所带电荷r 颗粒半径 介质黏度,相对迁移率（Rf）：分离区带的泳动速度可用相对迁移率来表示。测定迁移率时，在电泳结束后要先在指示剂移动的位置（前沿）作一标记（通常是插一根短铜丝），染色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。Rf 谱
6、带迁移距离/前沿指示剂迁移距离测量迁移率时，应以谱带的中部位置为准，值得注意的是，交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响迁移率。另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移速度。为了使试验重复性好，这些因子都应尽可能保持恒定。,一、琼脂糖凝胶电泳,1、原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。DNA
7、分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。,以对于分子量大的样品，如大分子核酸，病毒等，一般采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶的特点：天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖是直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列织成。,2、操作方法试剂与设备,上样buffer 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚
8、蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液以上溶液4 保存备用。,制胶：称干粉，融化，倒胶，插梳子，凝固，装电泳槽。,3、步骤 1g 琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60，加入100l的0.5mg/ml EB，并摇匀。）用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。用移液器吸取总DNA或质粒样品4l于封口膜上，再加入2l 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。打开电源开关，调节电压至3-
9、5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。,将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。,目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，琼脂糖是经过挑选，以质地较纯的琼脂作为原料而制成的。优点如下：琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量
10、测定。电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。,目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1g蛋白质就可检出。琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验 方法之一。,2023/5/28,韶关大学生命科学学院,25,PCR产物的琼脂糖电泳,2023/5/28,26,引物二聚体,2023/5/28,南京农业大学 生命科学学院,27,4
11、、影响因素1）琼脂糖 来源，纯度。酸根取代导致Agarose带电。对支持物的一般要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收。常用的支持物有滤纸，醋酸纤维素薄膜，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶等。支持物性质不同也会影响泳动速率，如琼脂于聚丙烯酰胺凝胶都有大小不同的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速率快，反之则慢。2）胶浓度,3）电场强度：电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场强度的不同，电泳可分为：常压(100-500V)电泳。其电场强度为2-10V/cm。分离时间较长，从数小时到数十
12、小时，适合于分离蛋白质等大分子物质。高压(2000-10000V)电泳。其电场强度为50-200V/cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。,4）溶液pH为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。对蛋白质而言，溶液pH值离等电点越远，则颗粒所带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。因此分离某种蛋白质混合液时，应选择合适的pH使欲分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大的差异。,2023/5/28,南京农业大学 生命科学学院,31,5）溶液的离子强度缓冲液离子强度越高，则颗粒的电动
13、电势越小，泳动度也越小。一般最适合的离子强度在之间。溶液离子强度(ionic strength)的计算公式如下：I=1/2cz2 式中，I为离子强度，c为离子的摩尔浓度(mol/L)，z为离子价数，价数越高，则离子强度越大。6）电渗电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附OH-离子带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影 响，故电泳时，电渗 小些为好。,7）温度电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。8）支持物现代电泳多在固体支
14、持物上进行，使样品中的不同组分形成不同的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以方便地进行染色等后续处理。,印迹转移电泳：生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的DNA进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作1975年，Southern创造了将经琼脂糖凝胶电泳后的DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜(NC膜)上，再进行杂交的方法，被称为Southern印迹法。随后出现RNA印迹（被戏称为Northern印迹），蛋白质印记（Western印迹）等。,交变脉冲电场凝胶电泳一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作
15、用下，迫使DNA变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大。如此时改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿新的泳动方向伸直，而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。1983年，Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间（外推为零的滞留时间）与DNA分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶。Carle等改进了电泳技术，并发现周期性的反转换电场亦能使大分子 DNA 通过电泳分开。,该电泳系统是由一个水平式电泳槽和两组独立，彼此垂直的电极组成，一组电极负极为N，正极为S；另一组负极为W，正极为E。一块正方形琼脂糖凝胶板呈45置于中央，电场在N-S和W-E之间交替建立。电
16、场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大小有关。电泳时，DNA分子处在连续间隔交替的电场中。首先向S极移动，然后改向E极。在每次电场方向改变时，DNA分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向。只有当DNA分子达到一定构型后，才能继续前进。DNA分子净移动方向与加样线垂直，使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数百万bp的大分子DNA。,4.4.交变脉冲电场凝胶电泳,免疫电泳：免疫电泳是以琼脂（糖）为支持物，在免疫的基础上，将琼脂（糖）区带电泳与免疫扩散相结合产生特异性的沉淀线、弧或峰。此技术的特点：样品用量极少，免疫识别具有专一性，分辨率高。在琼脂糖免疫双扩散的基
17、础上发展了多种免疫电泳，如微量免疫电泳、对流免疫电泳、单向定量免疫电泳（火箭电泳）、放射免疫电泳及双向定量免疫电泳等。上述各种电泳有其共性，但又有不同的操作方法及原理，详见后续章节。,二、RNA电泳检测1、原理与过程 RNA电泳基本同DNA电泳一样。但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解。另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。,2、试剂设备试剂:5 X MOPS电泳缓冲液：2
18、0.9g MOPS(0.1mol/L),pH7.0;8.3ml 3mol/L NaAC(40mmol/L);10.0ml 0.5mol/L EDTA(5mmol/L)pH8.0,用水定容至1L.以上药品和水均需用DEPC处理。10 x甲醛上样缓冲液：1mmol/L EDTA,pH8.0;0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯蓝，50%甘油).37%甲醛（pH 大于4.0，12.3mol/L）;甲酰胺;10mg/ml溴化乙锭.以上药品和水均需用DEPC处理。,3、步骤胶的制备：1.5g琼脂糖加115ml水，加热融化。冷却至60时加30ml的5 X MOPS电泳缓冲液(终浓度为1X);加5ml甲醛（琼
19、脂糖终浓度为1%）。制胶。样品制备：RNA(最多30ug)5.5ul 5 X MOPS电泳缓冲液 2.0ul 甲醛 3.5ul 甲酰胺 10ul 在65下处理15min,然后置冰上。加样品前，先用5v/cm电压电泳5分钟。制备好的样品短暂离心后加10X上样缓冲液2ul，混匀。上样。在1 X MOPS电泳缓冲液中电泳2-3小时。在电泳1-2小时后，可混合正负极缓冲液，再继续电泳。染色：将电泳好的胶板转移至含0.5ug/L溴化乙锭的0.1mmol/L NH4AC溶液中染色30-40min.（溴化乙锭也可以在电泳前加于样品中）,4、影响因素1）Agarose 来源，纯度。2）胶浓度 3）以乙二醛DS
20、MO做变性系统时，制胶时不加EB，电泳后浸胶入EB溶液。并需要buffer循环系统，避免形成过高的pH梯度。4）避免RNA因RNase污染而降解。,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE）。,聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。对pH和温度变化较稳定。几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。样品不易扩散，且用量
21、少，其灵敏度可达10-6g。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：分离范围不同琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。凝胶配置程序不同琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。凝胶的厚度不同琼脂糖凝胶最薄只能达到；聚丙烯酰胺凝胶可以制成.，分辨率高。成本不同。琼脂糖
22、价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高安全性不同。琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性,PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。聚丙烯酰胺凝胶电泳又有以下几种：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳连续密度梯度电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳,1、凝胶聚合的原理及有关特性1.1.聚合反应,聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下合成的。催化系统常用有两种：过硫酸氨TEMED化学催化聚合系统此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的
23、TEMED的加入，可使过硫酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。核黄素TEMED光聚合催化系统此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。,2023/5/28,南京农业大学 生命科学学院,49,1.2.凝胶孔径的可调性及其有关性质凝胶性能与总浓度及交联度的关系：凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比。T Acr和Bis总浓度C 交联剂百分比V 缓冲液体积
24、(mL)a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关。当a/b10时，凝胶脆而易碎，坚硬呈乳白色；a/b100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易于断裂。欲制备完全透明而又有弹性的凝胶，应控制a/b=30左右。,a Acr克数b Bis克数,不同浓度的单体对凝胶性能影响很大。Davis的实验发现Acr2%，Bis0.5%，凝胶就不能聚合。当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。通常，T为2%-5%时，a/b=20左右；T为5%-10%时，a/b=40左右；T为15%-20%时，a/b=125-200左右，为此Richard等(1965)提出一个选择c和T的经验公式；C=6.50.3T此公式适用于T为5
25、-20%范围内的c值，其值可有1%的变化。在研究大分子核酸时，常用T=2.4%的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖。在T=3%时，也可加入20%蔗糖以增加机械性能，此时，并不影响凝胶孔径的大小。,凝胶浓度与孔径的关系：T与C不仅与凝胶的机械性能有关，还与凝胶的孔径关系极为密切。一般讲，T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。此外，孔径还同Acr与Bis的比例有关，Bis占Acr总浓度5%时，孔径最小。凝胶浓度与被分离物相对分子量质的关系：由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的相对分子质量也不同。在操作时，可根据被分离物相对分子质量大小选择所需凝胶的浓度范围。也
26、可先选用7.5%凝胶(标准胶)，因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得较满意的结果。如分析未知样品时也可用4%-10%的梯度胶测试，根据分离情况选择适宜的浓度以取得理想的分离效果。,2023/5/28,韶关大学 生命科学学院,53,1.3.影响凝胶聚合的因素Acr及Bis的纯度：应选用分析纯的Acr及Bis，两者均为白色结晶物质，280无吸收。如试剂不纯，含有杂质或丙烯酸时，则凝胶聚合不均一，或聚合时间延长甚至不聚合，因而需进一步纯化。Acr及Bis固体应避光，贮存在棕色瓶中，因自然光、超声波及射线均可引起Acr自身聚合或形成亚胺桥而交联，造成试剂失效。Acr和Bis贮液的pH值为，当
27、pH值的改变大于0.4pH单位则不能使用，因在偏酸或偏碱的环境中，它们可不断水解放出丙烯酸和NH4+而引起pH值改变，从而影响凝胶聚合。因此，配制的Acr和Bis贮液应置棕色瓶中，4贮存，存放期一般不超过1-2个月为宜。,AP、核黄素、TEMED：是凝胶聚合不可缺少的试剂，AP应在干燥、避光的条件下保存，其水溶液应置棕色瓶中，4冰箱贮存，一般仅能存放一周。TEMED（液状）应密闭贮于4冰箱中。增加AP和TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。pH：碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少AP和
28、TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温(5)聚合凝胶会变得脆 而混浊，一般25-35聚合较好。氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱气，再加引发剂。,2、PAGE原理（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）PAGE电泳据电泳装置不同分为垂直的圆盘及板状两种。前者凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状，因而称为圆盘电泳；后者凝胶是在两块间隔几毫米的平行玻璃板中聚合，故称为垂直板状电泳。两者电泳原理完全相同。,蛋白质进行PAGE时，常用垂直板电泳。垂直板电泳的优越性有：表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条
29、带更清晰。在同一块胶板上可同时进行10个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电泳及放射自显影。胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，还可用于制备。胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存与扫描。可进行双向电泳。,PAGE据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为
30、支持介质，利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。,根据缓冲液的PH值的高低，可分为碱性系统、酸性系统和中性系统。不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶组成，排列顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶。样品胶的作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲溶稀释。目前一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40%蔗糖，同样具有防止对流及样品被稀释的作用。,浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及pH值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。分离胶的T
31、=7.0%-7.5%，C=2.5%，缓冲液为pH8.9的Tris-HCl，大部分蛋白质在此pH条件下带负电荷。此胶主要起分子筛作用。,2.1.样品浓缩效应凝胶孔径的不连续性：上述3层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在 电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。电位梯度的不连续性：电泳开始后，快离子的快速移动会在其后 形成一个离子强度很低的低电导区，使局 部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的 区带。,缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：在三层凝胶中均有Tris及HCl。
32、Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子。HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子。电极缓冲液中，除有Tris 外还有甘氨酸，其pI=6.0，在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1%-1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。血清中大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH6.7或8.3时均带负电荷向正极移动，迁移率介于快离子与慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此Cl及甘氨酸根沿着
33、离子界面继续前进。蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，逐渐分成多个区带。,2.2.分子筛效应大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当被浓缩的蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时，pH值和凝胶孔径突然改变，分离胶的pH值8.9接近甘氨酸的Pka值（9.79.8），这样慢离子的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加。此时慢离子的有效泳动率超过了所有蛋白质的有效泳动率。这样，高电势梯度不存在了，各种蛋白质仅会由于其分子量或构型的不同，在一个均一的电势梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶时所受阻滞的程度不同，表现的泳动率的不同而被分开。这种分
34、子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。,2.3.电荷效应蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所带有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个区带。在进入分离胶时，电荷效应仍起作用。目前，PAGE连续体系应用也很广，虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离，加之在温和的pH条件下，不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性。,变性PAGE原理聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓非变性凝胶，即在凝胶中不加变性剂，这种凝胶
35、中，蛋白质的迁移率受它的静电荷与分子大小两个因素的影响。因此在非变性凝胶中进行电泳是不能测得分子量的。所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系。因此利用变性凝胶进行电泳可以测得蛋白质的分子量。目前应用较多的变性剂为SDS。,变性PAGE原理SDS-PAGE时，在蛋白质溶解液中加入SDS和疏基乙醇。巯基乙醇可使蛋白质分子中二
36、硫键还原，使多肽分成单个亚单位。SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象的改变，并形成复合物。此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合 物的短轴相同，约1.8 nm，而长轴则与蛋白 质的Mr成正比。,目前，用SDS-PAGE研究过的蛋白质已有数百种，均证实此法测定蛋白质Mr的可靠性。测定未知蛋白质Mr时，可选用相应的一组标准蛋白及适宜的凝胶浓度，同时进行SDS-PAGE，则可根据已知Mr蛋白质的电泳迁移率和Mr的对数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得Mr。本方法有仪器设备简单，操作方便，样品用量少，耗时少(仅需
37、一天)，分辨率高，重复效果好等优点，因而得到非常广泛的应用与发展。它不仅用于蛋白质Mr测定，还可用于蛋白混合组分的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS-PAGE分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。,3、试剂与方法（略）4、影响因素1）蛋白质与SDS的结合2）离子强度3）样品制备 无沉淀，颗粒4）样品中存在阻碍gel聚合的成分，或易变性成分5）固定、染色 可能丢失小肽段。,2023/5/28,南京农业大学 生命科学学院,70,然而SDS-PAGE也有不足之处，尤其是电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白(如 糖蛋白)及一
38、些结构蛋白等测出的Mr不太可靠。如组蛋白F1，本身带有大量正电荷，虽然结合了正常量的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷，故用SDS-PAGE测得的Mr为35 000，而用其他方法测定的Mr仅为21 000。因此要确定某种蛋白质的Mr时，最好用2种测定方法互相验证。尤其是对一些由亚基或两种以上肽链组成的蛋白质，由于SDS及巯基乙醇的作用，肽链间的二硫键被打开，解离成亚基或单个肽链，因此测定结果只是亚基或单条肽链的Mr，还需用其他方法测定分子中肽链的数目。,连续密度梯度电泳（PG-PAGE）原理：连续密度梯度电泳使用的是从上至下的一个正的线性梯度凝胶，点在凝胶顶部的样品在电场中向着凝胶浓度逐渐增高
39、的方向即孔径逐渐缩小的方向迁移。随着电泳的继续进行，蛋白质受到孔径的阻力越大。电泳开始时，样品在凝胶中的迁移速度主要受到本身的电荷密度和样品分子的大小的影响。当迁移所受到的阻力大到阻以使样品分子完全停止前进时，那些跑得很慢的低电荷的样品分子将赶上与它大小相同但具有较高电荷密度的分子并停留下来形成区带。,因此在梯度凝胶电泳中，样品的最终迁移位置仅取决于分子本身的大小，而与样品分子的电荷密度无关。样品混合物中分子质量大小不同的组分，电泳之后将依分子质量大小停留在不同的凝胶孔径层次中形成相应的区带。,线性梯度凝胶制备线性梯度凝胶制备不同于均一浓度凝胶制备，应预先配制低浓度胶（2%或4%）贮液置贮液瓶
40、中；高浓度胶（16%或30%）贮液置混合瓶中（两者体积比为1/1），在梯度混合器及蠕动泵的协助下，从下至上灌胶。凝胶聚合后，则形成从下到上、从浓至稀依次排列的线性梯度凝胶。,PG-PAGE的优点：由于梯度凝胶孔径的不连续性，具有使样品中各个组分浓缩的作用，稀释的样品可以分次上样，不会影响分离效果可提供更清晰的蛋白质区带，用于蛋白质纯度的鉴定。可在一个凝胶板上同时测定数个相对分子质量相差很大的蛋白质。可直接测定天然状态蛋白质相对分子质量，而不被解离为亚基。因此，本法可作为SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的补充。尽管本法有上述优点，但主要适用于测定球状蛋白质相对分子质量，对纤维状蛋白相对分子
41、质量的测定误差较大。另外，由于相对分子质量测定仅仅是在未知蛋白质和标准蛋白质达到了被限定的凝胶孔径时（即完全被阻止迁移时）才成立，电泳时要求足够高的电压（一般不低于2000V），否则将得不到预期的效果。因此，采用PG-PAGE测定蛋白质相对分子质量有一定的局限性，需用其他方法进一步验证。,聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳（IEF-PAGE）原理：蛋白质是两性电解质，当pHpI时带负电荷，在电场中向正极移动；当pHpI时带正电荷，在电场中向负极移动；当pH=pI时净电荷为零，在电场中既不向正极也不向负极移动，此时的pH就是该蛋白质的等电点（pI）。聚丙烯酰胺凝胶中加入一种合成的两性电解质载体，在电场的
42、作用下会自发形成一个连续pH梯度。蛋白质样品在电泳中被分离。运动到等电点胶层时就失去所带电荷而稳定停留在该处并聚焦成带，样品中不同蛋白质组分等电点不同，因而在等电聚焦中得到有效的分离。在等电聚焦中，利用各蛋白质组分等电点的差异，并不利用凝胶的分子筛作用。,两性电解质载体是IEF-PAGE中最关键的试剂，它直接影响pH梯度的形成及蛋白质的聚焦。载体两性电解质必须具备的条件：它的化学组成应不同于被分离物，不干扰被分离物的鉴定。它的分子量要小，这样便于与被分离的物质分开。具有化学惰性，不与被分离物质反应，也不能使被分离物质变性。在等电点处必须具有足够的缓冲能力。在等电点处必须具有足够高的电导，以使一
43、定的电流通过。,pH梯度的形成：两性电解质载体是含有一系列pK和pI各自相异却又相近的脂肪族多氨基多羧基的混合物。将其混入到电泳支持物中，开始电泳后，各组分在中性溶液介质中都发生解离，并形成一个平滑稳定的由正极向负极逐渐上升的pH 梯度。,在防止对流的情况下，只要有电流存在就可以保持稳定的pH 梯度，因为此时由于扩散和电移动所引起的物质移动处于动态平衡。在此pH梯度中，各种蛋白质迁移到各自的pI处而得到分离。由此可见，该蛋白质在“自然”pH 梯度中，无论处于何种位置均会向其等电点移动，并最终停留在该处。,等电聚焦的优点是：有很高的分辨率，可将等电点相差0.010.02PH单位的蛋白质分开；一般
44、电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带变窄；由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点处，很稀的样品也可进行分离；可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01PH单位。缺点：电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，样品中的成分必需停留于其等电点，不适用于在等电点时发生沉淀或变性的蛋白质,四、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶双向电泳1、原理：双向电泳是一种由任意两个单向电泳组合而成的，在第一向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳的分离方法。经过电荷和质量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。,2
45、、电泳方法：1）制样 抽提要确保将全部蛋白质都提出来。2）一般第一向IEF-AGE用超薄水平板，电泳结束后切取所需泳道用于第二向电泳，或在1mm内径的毛细管中进行第一向IEF-PAGE，取出胶条用于第二向电泳。第一向电泳的方法同IEF-PAGE，只是制胶时要加入2%两性电解质和6mol/L尿素。3）第二向电泳时，先将SDS-PAG灌在垂直玻璃板之间，上部留2cm左右空间，待聚合后，将第一向胶条转移到第二向胶之上，用载玻片将胶条轻轻压直，加3L 1%溴酚兰指示剂，用1%的琼脂糖(用电极缓冲液配制)密封胶条，琼脂糖凝固后即可电泳。待溴酚兰将至凝胶板下方边缘时，停止电泳。第二向电泳时，用梯度混合器将
46、凝胶制成7.5%-15%的浓度梯度，可以提高电泳的分辨率。4）染色脱色,3、影响因素1）样品处理 需除尽盐、色素、核酸、酚，蛋白质需全部提取出来。2）样品越新鲜越好3）染料灵敏度4）蛋白质的含量、酸碱性、最大最小蛋白质的分离程度，对难溶蛋白的检测。,双向电泳示意图,电泳目前，已有5000余种蛋白质分采用IEF/SDS-PAGE得到很好的分离，其高分辨率是各种类型单向PAGE及其他双向PAGE所无法比拟的。因此，IEF/SDS-PAGE双向电泳已成为当前分子生物学领域内常用的实验技术，可广泛用于生物大分子如蛋白质，核酸酶解片段及核糖体蛋白质的分离和精细分析，是蛋白质组学的基本方法。随着该技术的不
47、断改进与发展，其应用范围将更加广泛。然而，此技术对某些碱性蛋白质的分离却有其局限性，因在第一向IEF-PAGE的电泳体系中，含有高浓度的尿素，它的存在会使碱性区的pH梯度变得很窄而且不稳定，可使碱性蛋白质难以进入凝胶中或者易泳出凝胶外。因此，对碱性蛋白质的分离分析应采用其他方法。,蛋白质电泳检测（染色）技术,经醋酸纤维薄膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的各种生物分子需用染色法使其在支持 物相应位置上显示出谱带，从而检测其纯度、含量及生物活性。蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸及酶等均有不同的染色方法。蛋白质染色染色液种类繁多，各种染色液染色原理不同，灵敏度各异。使用时可根据需要加以选择。常 用的染
48、色液有：氨基黑10B氨基黑10B是酸性染料。其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用蛋白质染料之一，但对SDS-蛋白质染色效果不好。氨基黑10B染不同蛋白质时，着色度不等、色调不一，定量时误差较大，需要对各种蛋白质作出 本身的蛋白质-染料量(吸收值)的标准曲线，更有利于定量测定。,蛋白质染色考马斯亮蓝R250（简称CBB R250）考马斯亮蓝R250的max=560-590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。该染料是 通过范氏作用与蛋白质结合，适用于SDS电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超过一定范围时，染色不合科Beer定律，作定量分析时要注意这点。考马斯亮蓝G250（简称CBB G250）蓝马斯
49、亮蓝G250的max=590-610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。其优点是在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地使蛋白质染色而几乎无本底色，所以常用于需要重复性和稳定性的染色，适于用定量分析。（两种CBB染色法的缺点见本页备注）固绿固绿的max=625nm，酸性染料。染色灵敏度不如CBB，近似于氨基黑，但却可克服CB B在脱色时易溶解出来的缺点。,蛋白质染色荧光染料丹磺酰氯：在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质的末端氨基反应，使它们获得荧光性质，在波长320nm或280nm的紫外灯下，观察染色后的区带或斑点。荧光胺：其作用与丹磺酰氯相似。由于自身及分解产物均不 显示荧光，因此染色后没
50、有荧光背景。只是由于引进了负电荷，会引起电泳迁移率的改变，但在SDS存在下这种电荷效应可忽略。近来，荧光胺常用于双向电泳的蛋白染色。2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮(MDPF)：其作用与荧光胺类似，也是与末端氨基产生 反应而产生荧光。1-苯胺基-8-萘磺酸：常用其镁盐，本身无色，但与蛋白质结合后，在紫外光下可见黄绿色荧光。银染色法此法较CBB R250灵敏100倍，染色机制可能与摄影过程中Ag+的还原相似。,2023/5/28,南京农业大学 生命科学学院,89,2023/5/28,南京农业大学 生命科学学院,90,糖蛋白染色过碘酸-Schiff试剂阿尔山蓝染色脂蛋白染色油红O染色苏丹黑B
