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1、生 物 化 学 实 验,商丘职业技术学院教务处,1教学目的掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能；掌握分光光度计的使用、离心技术、电泳、层析等的原理和操作技能；掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。,第一节 生 物 化 学 实 验 绪 论,2 通过生物化学实验主要做到,学习设计或验证一个试(实)验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告
2、的写作能力，能够科学、规范、清洁、整齐地进行所有的实验。掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技能，为今后参加科研及技术工作打下坚实的基础。,3 实验记录,实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂家等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。,1)生物化学实验不同于化学和生物学实验，而有其独特的实验技能和基本操作。课前必须认真预习，明确实验目的、原理、操作关键步
3、骤及注意事项。2)要十分注意实验安全，未经实验指导老师允许不得开、关任何电源和仪器设备开关（按钮）。3)实验时应本着认真、积极的态度，在教师的指导下完成每次实验。注意观察实验过程中出现的现象和结果，并对实验结果展开讨论。结果不良时，必须重做。4)实验中，听从老师指导，严格遵守操作规程，取用试剂时，应仔细辨明标签，以免取错。取完试剂后，应及时将瓶盖盖好，放回原处，切忌乱拿乱放，“张冠李戴”。并应及时将实验结果和原始数据如实记录在实验报告上，按时写出实验报告。5)实验后，必须把仪器洗净放入仪器柜内；清扫实验台面、地面；试剂瓶要摆放整齐。要经常保持实验室内清洁，不乱丢纸屑及所有固体废弃物。6)自觉遵
4、守课堂纪律，不迟到早退；保持室内安静；不高声谈笑。同学间应互助友爱。,4 实验室规则,7)爱护实验器材，非本次实验使用的仪器设备未经老师允许不得乱动。本次实验必须使用的仪器设备，在了解仪器性能和操作规程之前，不得冒然使用，更不可擅自拆卸或将部件带出室外。实验过程中，如发现设备损坏或运转异常，应立即报告老师。8)实验室内严禁饮、食及吸烟!对腐蚀性或易燃性试剂，操作时要格外小心。如酒精、乙醚等低沸点有机溶剂，使用时应禁明火，远离火源，若需加热要用水浴加热，不可直接在火上加热。用吸量管吸取试剂时应使用吸球，严禁用嘴吸取。对于有毒、腐蚀的试剂更应注意，应避免其直接接触人体及衣物。乙醚、丙酮等易燃试剂应
5、远离火源，以免发生意外。9)注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒入水槽，放水冲走，有毒废弃物应放入废物缸并及时作无害化处理,实验用过的棉花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随意乱扔或丢进水槽。10)每次实验课由学生轮流值日。值日生要负责打扫实验室的卫生，整理实验室。检查水、电，关好门窗，经老师检查后，方可离开实验室。,4 实验室规则,5 实验须知,实验前应作好预习，认真阅读实验指导。明确实验目标，能简述实验内容及主要的操作步骤。实验过程中，应根据实验指导及老师的要求，认真操作，细心观察，如实记录。严禁捏造实验数据，提倡实事求是的科学态度，实验做错应要求重做，反对弄虚作假。实验
6、结束后，要认真书写实验报告，及时交老师批阅。,6 实验报告,实验报告包括如下内容：实验项目(实验题目）;实验目的;实验原理;实验器材;主要操作步骤;实验结果;问题分析与讨论等。,第二节 紫外-可见分光光度计的使用原理和方法,紫外-可见吸收光谱朗伯-比耳定律紫外-可见分光光度计分析条件的选择测定方法,目视比色法回顾,比较溶液颜色深浅，从而确定被测定组分含量的方法，称为目视比色法。目视比色法的准确度和精密度受视力条件影响很大，一般相对误差约在520的范围。,常用的目视比色法,最常用的目视比色法是标准系列法:取一套比色管，于各管中分别加入一系列不同体积的标准溶液，在测定条件下进行显色定容。此时一系列
7、标准溶液的管中显出由浅到深的色阶。被测溶液在同一条件下显色:将被测溶液管与标准系列进行比较，若与其中某一管颜色相同可认为被测溶液浓度与此管浓度相等，若被测溶液颜色介于两标准颜色之间，可认为被测溶液浓度等于两管浓度的平均值。,常用的目视比色法,特点,利用自然光,比较吸收光的互补色光,准确度低（半定量）,不可分辨多组分,方法简便，灵敏度高,1)紫外-可见分光光度法(UV-VIS),按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。,它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析,所依据的光谱是分子或离子吸收入射光
8、中特定波长的光而产生的吸收光谱。,2.1紫外-可见吸收光谱,紫外光：远紫外光（10-200 nm）和近紫外光（200-400 nm）的电磁辐射。可见光：400-800 nm的电磁辐射。溶液中物质选择性的吸收可见光中某种颜色的光，溶液就会呈现出一定的颜色。比色分析法：比较有色物质溶液颜色深浅来确定物质含量的方法。分光光度法：使用分光光度计进行吸收光谱分析的方法。,2)紫外-可见分光光度法的特点：,(1)与其它光谱分析方法相比，其仪器设备 和操作都比较简单，费用少，分析速度快;,(2)灵敏度高;,(3)选择性好;,(4)精密度和准确度较高;,(5)用途广泛。,3)紫外-可见吸收光谱,物质对光的选择
9、性吸收,物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。,通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长max进行物质含量的测定。,吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以A作图 吸收光谱特征：定性依据 吸收峰max 吸收谷min 肩峰sh,图示,吸收曲线的讨论：（1）一种吸光物质对不同波长的光吸收程度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。（2）同一种物质浓
10、度不同，其吸收曲线形状相似max不变。在max处，吸光度A正比于浓度C 测定最灵敏（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。,4)影响紫外-可见吸收光谱的因素,物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等可能发生变化。温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。,溶剂 注意如下几点：（1）尽量选用低极性溶剂；（2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；（3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。,5)紫外-可见吸收光谱的应用,紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可
11、以用于物质的定性分析、纯度鉴定。,2.2 朗伯-比尔定律,设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为 It，则 I0=Ia+It,吸光度和透光度,溶液的吸光定律,透光率（透射比）Transmittance,透光率定义：,T 取值为0.0%100.0%,全部吸收,T=0.0%,全部透射,T=100.0%,吸光度:为透光度倒数的对数，用A表示A=lg1/T=-lgT=lgI0/It,透光度：透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示：即 T=It/I0,朗伯-比尔定律朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
12、A=kc l 式中比例常数k(吸光系数)与吸光物质的本性、入射光波长(单色光纯度)及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。,朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。,偏离朗伯-比耳定律的因素,（1）入射光为非单色光,（3）光程的不一致性。光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。,（2）溶液的不均性。实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可使吸光质点的吸光特性变化大。,2.3 紫外-可见分光光度计,基本结构:光源单色器吸收池检测器信号显示系统,样品,光源,单色器,吸收池,检
13、测器,信号显示系统,组 成 部件,主要部件,光源：用于提供足够强度和稳定的连续光谱。分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯,钨灯和碘钨灯可使用的范围在350 2500 nm；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。,它们可在180 400 nm范围内产生连续光源。在紫外光区只能用石英比色皿。紫外可见分光光度计通常都配有可见和紫外两种光源。,光源：提供符合要求的入射光。要求：在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,紫外光源-氘灯(180-400 nm)(气体放电光源),可见光源-钨灯(
14、350-2500nm)(热辐射光源),光 源,单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。,2 单色器,单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。单色器的作用从波长范围较宽的入射光线中，过滤分出波段较窄的单色光,吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。,3 吸收池,吸收池的种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。,玻璃能吸收UV光，仅适用于可见光区石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）,4 检测器 检测器的作用是检测光信号，将光信号转变为
15、电信号并予以放大。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。,5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。,比色法的定量方法：标准曲线法:将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度,（一）单组分的定量方法,A=Kc l,续前,标准曲线法,AX,CX,A（吸光度）,C（浓度）,实验室常用的水:自来水 去离子水不是没有离子的水，而是经过离子交换得到的没有干扰离子，PH值中性的水，干扰离子一般指钙、镁、碳酸根、硫酸根等，但是去离子水一般含有的有机物质是不能去除的。蒸馏水是经过多次蒸馏得到的，有一次、二次之分，一般的有机杂质可以去除，但是无机离子还是存在。,还原糖与DNS 反应产生棕红色物质,加入足够量的酒石酸钾钠是为了消除溶解氧的影响,添加苯酚可增加试剂的显色作用,添加亚硫酸钠可进一步增强试剂的稳定性.,
