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1、第六章 生产菌种 的生产,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩大培养的概念:,种子扩培的目的：,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，个体与群体活力强，移种 至发酵罐后，能够迅速生长,无杂菌污染,一、孢子的制备（一）放线菌孢子的制备 采用琼脂斜面培养基，培养基中含适合产包子的麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和无机盐等，碳源和氮源不要太丰富。温度28或37，培养514天。,第一节 种子制备过
2、程,（二）霉菌孢子的制备 以大米、小麦、玉米、麸皮等天然农产品为培养基。温度25 28，培养4 14天。,（三）细菌孢子的制备 细菌的斜面培养多采用限制碳源而氮源丰富的牛肉膏、蛋白胨培养基。温度37 或28，培养510天。,二、种子的制备,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,（一）实验室阶段,1、培养物选择的原则,目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分
3、为两类：,对于不产孢子和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的菌体,对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。,获得一定数量和质量的孢子,菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。,对于产孢子的微生物,获得一定数量和质量的菌丝体,便于操作，但需要更仔细的控制。,2、培养基选择的原则,培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。,在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。,3、起始接种物的传代问题,细菌,保藏斜面 活化斜面,产孢子,保藏
4、 母斜面 子斜面,目的：使菌种的传代次数尽可能的少。,（二）生产车间阶段,1、培养物的选择原则,在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。,缩短发酵时间,有利于获得好的发酵结果,菌丝体比孢子要有利：,2、培养基选择的原则,目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。,在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本 二是驯化,3、发酵级数的确定,谷氨酸：三级发酵,一级种子（摇瓶）二级种子（小罐）发酵,青霉素：三级发酵,一级种子（小罐）二级种子（中罐）发酵,一般由菌丝体培
5、养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数,发酵级数确定的依据,级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响,级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。,在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面,放线菌发酵生产的工艺流程,菌种 母斜面 子斜面 摇瓶种子 种子罐 发酵罐,青霉素生产的种子制备制备过程,安培管,斜面孢子,大米孢子,一级种子,二级种子,发酵,1.斜面孢子,培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天,注意湿度50%左右,2.大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本低、米
6、粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子,3.一级 种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27，40小时,接种量：200亿孢子/吨,4.二级 种子,培养基：同上,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,谷氨酸生产的种子制备制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,1、斜面,培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%，,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面
7、要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次,2.一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培 养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基,3.二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,种子的质量要求：,108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列时结束，活力旺盛,第二节 种子质量的
8、控制,种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件。,一、影响孢子质量的因素及其控制,孢子质量与培养基、培养温度、培养时间和接种量等因素有关，这些因素相互联系、相互影响。,（一）培养基,原材料的质量 水,（二）培养温度和湿度,1.温度获得孢子的最适温度范围区间很窄。例如：龟裂链霉菌斜面的最适温度为36.537。2.湿度 北方湿度控制在4045，南方湿度控制在3542，所得孢子质量好。一般来说，真菌对湿度要求高，放线菌对湿度要求低。,（三）培养时间和冷藏时间,丝状菌在斜面培养基上的生长发育过程可分为五个阶段：孢子发芽和基质菌丝生长阶段、气生菌丝生长
9、阶段、孢子形成阶段、孢子成熟阶段、斜面衰老菌丝自溶阶段。,过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子会导致生产能力下降。孢子冷藏的时间宜短不宜长。,母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。,子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落 接种时密一点，得到大量的孢子。,孢子培养时注意湿度，且子斜面使用一般不超过1个月,（四）接种量,二、影响种子质量的因素及其控制,种子的质量要求：,量：要求达到一定的浓度,质:形态（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：C、N、P的含量，pH、酶活等,无污染,种子质量重要受孢子质量、培养基
10、、种龄和接种量等因素影响。摇瓶种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝浓度和黏度以及糖代谢、pH变化为指标。,（一）培养基,易于被菌体直接吸收和利用，营养成分适当丰富和完全，氮源和维生素含量较高，总浓度较细薄。,（二）培养条件,温度 pH 通气搅拌,（三）种龄,种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,种龄短：生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及菌体太少,菌丝结团；种龄长：生产能力下降。,原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。,细菌 724小时 霉菌 16 50小时 放线菌 21 64小时,（四）接种量,移入种子的体积接种量 接种后培养液
11、的体积,大接种量可加速产物的形成，但会导致菌体生长过快、过稠，造成营养基质缺乏和溶解氧不足。接种量过小会导致发酵前期菌体生长缓慢，发酵周期延长，菌丝量少，产生菌丝结团。,过大过小都不好，最终以实践定，如霉菌素发酵的接种量为0.1%1%，肌苷酸发酵接种量为1.5%2%，霉菌的发酵接种量为10%，大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。,双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。,倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。,（五）种子质量标准,细胞或菌体（菌体形态、浓度、培养液外观）生化指标（糖、氮、磷含量的变化和pH)产物生成量酶活力,（六）种子异常分析,菌种生长发育缓慢或过快 菌丝结
12、团 菌丝粘壁,（七）种子质量的控制措施,种子质量的优劣是通过它在发酵罐中所表示的生产率体现的。因此必须保证生产菌种的稳定性，在种子培养期间保证提供适宜的环境条件，保证无杂菌浸入，从而获得优良的种子。,菌种稳定性的检查,生产中所用的菌种必须保持稳定的生产能力，不能有变异种。尽管变异的可能性很小，但不能完全排除这一危险。所以，定期检查和挑选稳定菌株是必不可少的一项工作。,方法是：将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。,杂菌检查,在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。一般的方法是：显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检。此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取样测其营养消耗速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味是否异常等等。,本章小节：,了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念,理解种子扩培的目的和要求,掌握控制种子质量的基本方法和手段,作业,影响种子质量的因素及其控制,
