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1、生物制药工艺学,发酵工程制药,第一节：微生物细胞工程（发酵工程制药）生产原理第二节：利用微生物进行药物的生产实例,第一节：微生物工程（发酵工程制药）生产原理,人工培养的微生物，通过体内的特定酶系，经过复杂的生物化学反应过程和代谢作用，最终合成人们所需要的药物如抗生素、氨基酸、有机物、维生素。这种方法称为微生物细胞工程。,一：最常用的工业微生物二：微生物的培养技术三：细胞浓度的测量四：微生物发酵的工艺学原理五：工业微生物菌种的制备和改良六：发酵生产过程七：灭菌技术八：分离纯化技术九：干燥技术,讲解分章节内容,一：最常用的工业微生物,1：细菌2：放线菌3：霉菌4：酵母 青霉菌,1：细菌,（1）醋杆
2、菌属-醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）可以将酒精转变为醋酸。弱氧化醋杆菌（Acetobacter suboxydans）可以将山梨糖醇转变为山梨糖。（2）乳杆菌属-德氏乳杆菌（Lactobacillus delbriiekii）可以将糖转变为乳糖。（3）链球菌属（Streptococcus）-用来生产乳酸。（4）片球菌属（Pediococcus）-用来生产乳酸。（5）串珠菌属（Leuconostoc）-用来生产乳酸。（6）芽孢杆菌属-枯草杆菌（Bacillus subtilis）可以用来生产-淀粉酶、肌苷、鸟苷等核苷。（7）梭菌属-丙酮丁醇梭菌（Clostridium acet
3、obutylium）用来生产丙酮、丁醇。（8）大肠杆菌（Escherichia coli）用来作为基因工程的克隆菌。,2：放线菌,有以下分类,红霉素链霉菌（S.enytnreus）能产生红霉素。,卡那霉素链霉菌（S.kanamycetieus）能产生卡那霉素,金霉素链霉菌（S.aureofaciens）能产生金霉素。,委内瑞拉链霉菌（S.veneznelae）能产生氯霉素,3：霉菌,（1）曲霉属-米曲霉（Aspergillus oryzae）能产生高峰淀粉酶。（2）黑霉属（A.niger）-能产生酸性蛋白酶、蛋白酶。（3）青霉属-点青霉（Penicillium.notatum）、产黄青霉（P.
4、chrysogenum）能产生青霉素。橘青霉（P.citrinum）可产生核酸酶P1。,4：酵母,酵母属-最常用的是酿酒酵母，用于进行酒精发酵。,二：微生物的培养技术,（一）培养基组成（二）培养基的分类（三）培养方法（四）培养条件,（一）培养基组成,1、碳源一般为蔗糖、葡萄糖。工业用碳源为淀粉水解液、糖蜜、干薯粉、甲醇、乙醇、石油、醋酸等等材料。,2、氮源主要有硫酸铵、尿素、豆饼水解液。,3、无机盐磷酸二氢钾、磷酸氢二钾七水硫酸镁。,4、微量生长因子生物素硫铵素玉米浆最常用,（二）培养基的分类,1、细菌用培养基以肉汤+蛋白胨+酵母膏作为其组成物质。,2、酵母、霉菌用培养基-以曲汁和麦芽汁为最常
5、用将米曲（或者麦芽汁）添加适量水，在55下糖化2小时，经过过滤，滤液稀释至糖度10度，备用。,3、培养霉菌则专用蔡氏霉菌培养剂蔗糖20-30g、硝酸钠3g、磷酸二氢钾1g、氯化钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、蒸馏水1L。,4、工业用培养基-定量组成培养基配方,（三）培养方法,按培养基类型分为-固体培养法、液体培养法。按操作方式分为-分批培养、半连续培养、连续培养。按氧气供应分为-需氧培养、厌氧培养。,下面分别介绍其中重要的5种方法：,1、浅盘培养,该方法选用于固体培养法、也适用于液体培养法。其方法是将固体或者液体培养基盛于不锈钢制的浅盘内，接种菌种，在保温室内培养。,2、厚
6、层通风培养,此方法用于固体培养。这种方法的优点是培养量大，并且节省劳动力。国内酱油厂多采用此法。,所用设备是在水面建造大型水泥槽水泥槽底部铺上多孔板板上放置固体培养基接种之后将空气由多孔板下部通入培养基内,3、液体通风深层培养,简称深层培养法，是最先进的方法。在我国，抗生素、柠檬酸的生产常常采用此法。,4、厌氧培养,（1）简单的方法是，用一般的发酵槽，撤去通风设备。（2）真正的方法是必须把氧气抽除，采用真空泵来抽去氧气。,较为先进的方法是加拿大的BBL Gas Pak 150的厌氧培养器采用由水发生氢气的方法此氢气与氧气反应，遂形成真空。,5、大规模发酵生产,一般采用几千升、几万升的培养罐。采
7、用逐步扩大法生产,将酵母进行斜面培养,移至500L的种子罐作为工业发酵的种醪,移至含5ml曲汁的试管之中30培养24小时。,移至10L的曲汁卡瓦罐中30培养48小时。,移至500ml的巴士瓶中30培养48小时,最后进行大规模培养,（四）培养条件,1、培养基浓度2、温度3、PH值4、氧气5、氮源6、微量因子,1、培养基浓度,一般为含葡萄糖10%最高可以通过流加法达到15%。,2、温度,一般为30-33超过33时应该进行冷却。,3、PH值,（1）酵母菌为（2）细菌的PH=6.0-7.5（3）霉菌生产的PH值则在之间。,4、氧气,微生物的类别有需氧菌、厌氧菌、兼性菌三种。各自需要不同的氧气条件。,测
8、定培养剂的溶解氧是一个技术关键。,5、氮源,一般情况下，是以使用尿素为最适合，因为一则尿素可以维持发酵液的PH值不变，同时又能够供给氮源的需要。,使用硫酸铵时，由于其残留的硫酸根使得发酵液PH值变小必须用碱性物质中和,6、微量因子,主要是指维生素，它是微生物生长所不可缺少的营养成份所需。,很多天然的碳源与氮源之中一般均含有众多的维生素物质配制培养基时一般不需另外添加,三：细胞浓度的测量,（一）直接测定法（二）间接测量法,（一）直接测定法,特点是直观精确,4浊度法,3平板计数法,2显微计数法,1细胞干重法,1、细胞干重法,将一定体积的培养液离心，收集细胞，洗涤、干燥、进行称重。,不足之处是此方法
9、不适用于统计含有不溶性沉淀物的培养液。,2、显微计数法,利用显微镜和血球计数器、测定单位体积内培养液中的细胞个数。,缺点是：（1）不适用于丝状生物体的计数。（2）不能区别活细胞和死细胞。（3）由于细菌太小，不适于进行计数。,3、平板计数法,将样品用无菌生理盐水进行逐一数量级的稀释然后取一定量的稀释液涂于琼脂平板培养基上，经过一段时间的培养，从平板上长出的菌落数量，可以计算出原培养液中微生物的浓度。,其优点是可用于测定活细胞的浓度,4、浊度法,由于培养液的浊度和光密度与培养液中的细胞浓度成正比关系，因此，可以通过分光光度计法用600-700nm波长进行测定。其优点是快速、准确。,（二）间接测量法
10、,1、测定细胞成份-可以通过测定培养液中蛋白质、DNA、RNA的含量来确定细胞的浓度。2、培养液中细胞虚体积的测定-将一定体积的培养液在一定速度下离心，由于不溶性成份的密度较大，经过离心后，一般均沉入底部，而活细胞则呈现出半悬浮状态，因此，沉降物总量-沉淀物的数量=细胞的估算量。3、粘度-培养液的粘度与所含的细胞数量有关。4、利用培养过程中产生热量的多少来测定细胞的数量。5、利用发酵过程中营养物质的消耗量来测定细胞的浓度。6、利用最终产物的合成数量，来测定培养液中细胞的数量。7、利用荧光素测定细胞中ATP的数量，测定活细胞的浓度。,四：微生物发酵的工艺学原理,（一）分批培养（二）连续培养（三）
11、其它培养方法,（一）分批培养,3点,1、分批培养的定义,2、分批培养的生长过程,3、分批培养过程中影响细胞生长的因素,1、分批培养的定义,分批培养是一种间歇式的培养方法，在每一批次的培养过程中，不再加入其它营养物料。待生物反应进行到一定程度之后，将全部培养液倒出、进行后道工序的处理。,为了提高生物反应器在分批培养中的效率通常采用多级分批培养的办法。即在小型生物反应器中接入少量种子经过分批培养，来获得较大数量的细胞作为种子再转入到大型生物反应器中,分批培养的设备要求较少操作也较简单工业微生物生产中经常采用,2、分批培养的生长过程,培养中的细胞经过4个生长阶段：（1）延迟期（2）指数生长期（3）静
12、止期（4）衰亡期,1、延迟期（1）种龄越长，延迟期越长，（2）接种量越少、延迟期越长,4、衰亡期营养物质消耗贻尽培养液中有害物质积累太多导致培养液中的细胞开始死亡，称为衰亡期。,3、静止期随着营养物质被逐渐消耗、细胞的生长速率开始下降，最终细胞浓度不再增加，称为静止期。,2、指数生长期细胞的倍增时间指细胞浓度增长一倍所需要的时间。微生物的倍增时间一般为0.51小时。,3、分批培养中影响细胞生长的因素,共有以下5种影响因素：（1）营养物质浓度（2）温度（3）PH值（4）溶解氧浓度（5）产物,（1）营养物质浓度,营养物质的限制性浓度-当某一种营养物质的浓度下降到一定程度之后，就会影响细菌的生长，此
13、时的浓度就称为营养物质的限制性浓度。营养物质的最大浓度-当某一种营养物质的浓度超过一定程度之后，也会对细菌的生长产生抑制作用。,（2）温度,当培养温度偏低时，细胞的生长速率较低，随着温度的升高，细菌的生长速率也随之加快，当温度超出一定范围时，由于蛋白质等细胞结构的变性，导致细菌生长速率的急速下降。,微生物细胞的最适生长温度并不等于其代谢产物的最佳生产温度。因此在具体的生产过程中，培养的前期常常将温度调控在有利于细胞生长的区域，而在后期则常常将温度转到最佳的生产温度，以获得较多的产物,根据培养温度的要求的不同，可以将微生物分成-低温菌，中温菌，高温菌。采用高温菌生产有许多优点：（1）高温菌所生产
14、出的酶，其热稳定性较好。（2）高温菌的培养温度较高，细胞的生长速率较大。（3）不容易发生杂菌污染。（4）在大规模生产时可以节约冷却水、同时能够减少动力消耗。,发酵温度调控技术,（3）PH值,细菌适宜于在中性、弱碱性的条件下生长。酵母菌、霉菌则喜酸性环境。乳酸菌、醋酸菌对于低PH值环境有着很好的耐受性。,（4）溶解氧浓度,不同的培养过程对于溶解氧有着不同的要求应该根据具体情况来加以控制。,空气过滤片,（5）代谢产物的抑制作用,细胞的代谢产物会影响到细胞的生长，这种现象称作产物抑制作用。而代谢产物多数就是生物制物的原材料。因此，在实际生产过程中要设法定期收集细胞的代谢产物,（二）连续培养,1、连续
15、培养方法的优缺点2、连续培养法的分类,细菌连续培养的设备简化示图,1、连续培养方法的优点（1）细胞生长速率较高。（2）连续培养可发使得培养液达到一个稳定状态,2、连续培养方法的缺点（1）连续培养延续的时间长，发生杂菌污染的概率也就增加（2）长时期进行连续培养，细胞发生变异、质粒丢失、基因突变、（3）细菌株生产性能退化的现象也就比较突出,3、连续培养法的分类,可以分为以下3类：（1）单级连续培养（2）细胞回流式的单级连续培养（3）多级连续培养,（1）单级连续培养,新鲜培养基的加入速率=培养之后的物料抽出速率。这种培养方法称为单级连续培养法。在单级连续培养方法之中，发酵液体积保持恒定，生物反应器中
16、各组分分布均匀。单级连续培养是一种最简单的连续培养方法。,（2）细胞回流式的单级连续培养,将单级连续培养流出液中的细胞加以浓缩，然后再送回到生物反应器中，这种方法称为细胞回流式的单级连续培养。细胞回流式的单级连续培养相当于不断地对生物反应器进行接种，有利于提高连续培养的效率。,（3）多级连续培养,将几个生物反应器串联起来，第一个反应器的流出液作为第二个反应器的流入液，第二个反应器的流出液又作为第三个反应器的流入液，这种培养方式就称为多级连续培养法。,（三）其它培养方法,共有5种方法：1、补料分批培养2、透析培养3、萃取培养4、闪蒸培养5、离子交换培养下面着重介绍1、2 二种方法,1、补料分批培
17、养,补料分批培养法是介于分批培养和连续培养之间的一种操作方法。是指在进行分批培养中间，向生物反应器中加入营养物质进行补料，但同时不取出培养液的方法。（1）方法改良（2）补料分批培养的优点（3）补料分批培养的缺点,由于补料，使得培养液的体积逐渐扩大，到一定时间之后，再将培养液从反应器中一次性放出,（1）方法改良,连续补料分批培养法-在进行补料分批培养时，如果所取出的培养液数量少于补进的物料数量，反复进行多次的放料和补料操作，这种方法称为连续补料分批培养。,（2）补料分批培养的优点,（1）通过流加高浓度的营养物质，培养罐内的细胞浓度可以达到非常高的程度这对于细胞产物的生产十分有利,（3）通过补料，
18、能够解除某些营养物的低浓度限制效应提高产物的合成效率。,（2）通过补料和放料的连续进行，能够解除某些基质、产物对细胞的抑制作用,（3）补料分批培养的缺点,（1）要考虑到生物反应器的供氧能力,（2）要考虑培养过程中大量代谢产物积累后的细胞毒性,2、透析培养,在培养过程中，随着细胞的生长，在培养液中会积累起各种代谢产物，这些物质常常会抑制细胞的生长。此时，采用透析膜把一些代谢产物排出反应器之外，这种方法称为-透析培养。（1）方法改良（2）透析培养的优缺点,（1）方法改良,如果采用微孔过滤膜把一些代谢产物排出反应器之外，这种方法称为过滤培养。,（2）透析培养的优缺点,透析培养的优点-对于消除产物的抑
19、制效应十分有效。透析培养的缺点和问题-经常遇到的困难是膜易被堵塞。,五：工业微生物菌种的制备和改良,1：菌种及其来源2：抗生素菌种的改良技术,1：菌种及其来源,菌种，是进行工业发酵、生产产品的重要条件。优良的菌种能够提高发酵产品的产量、提高发酵液的利用效率、缩短生产周期。自然界是生产菌种的主要来源，但是，直接从自然界分离得到的菌种往往不能立即用于生产目前，生产上所需要的菌种常常是从保存的菌种中筛选所获得的。,2：抗生素菌种的改良技术,具体有3种方法-（1）人工诱变法（2）原生质体融合法（3）体外DNA重组法,（1）人工诱变法,抗生素产生菌用紫外线、射线、X射线、快中子等物理方法，或者用亚硝酸、
20、秋水仙素、氮芥子气、硝基胍等化学诱变剂处理，来提高抗生素的产量。,（2）原生质体融合法,Pesti于1979年提出用原生质体融合法来提高青霉素的产量。我国四川抗生素研究所于1983年通过原生质体融合法生产麦迪霉素，产量提高40%。,（3）体外DNA重组法,采用体外DNA重组技术来改良抗生素生产菌。英国D.Flopwood首次在链霉菌之间进行了基因转移。产生出世界首创的杂合抗生素-麦迪紫红素。,六：发酵生产过程,生产用菌种-原始材料-培养基-程序-生产细则-以青霉素为例讲解,（1）青霉素（penicillin）,所用菌种-黄青霉菌原始材料-氨基已二酸、半胱氨酸、缬氨酸。发酵方法-加前体物质的深层
21、发酵法。,青霉素发现者弗莱明,沙土管菌种转移到固体琼脂斜面培养基上，24培养5-6天，获得芽孢芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养,进入移种瓶培养进种子罐，接种量为5%-10%进繁殖罐，28培养48-96小时进入发酵罐，开始生产。,鼓式过滤第一次萃取器纯化柱第二次萃取器第三次萃取器,真空结晶釜瓷过滤器结晶洗涤釜真空干燥器（结束）,程序,（1）使用消沫剂，由于发酵过程中产生大量的CO2，会产生大量泡沫。可采用植物油、豆油、合成消沫剂进行消沫处理。（2）温度控制在24-30、PH值控制在6.8-7.2。（3）应该注意控制残糖量、还原糖量、PH值、氨、氮、溶解氧量。（4）发酵过程中要注意通气搅拌，所通入
22、的空气必须是无菌的。（5）发酵罐必须保持正压（20-30kPa），以防罐外不洁净的空气流入。（6）目前国际上青霉素发酵的水平已经达到8万多单位/ml，相当于50g/L。,生产细则,七：灭菌技术,灭菌操作是为了保证杂菌不进入工业发酵系统。（一）灭菌项目（二）灭菌方法（三）灭菌的矛盾之处（四）具体的灭菌技术,（一）灭菌项目,1、在投入生产之前，必须对设备、管道进行彻底清洗、和严格灭菌。2、对通入的培养基、通入的空气进行先行灭菌。,（二）灭菌方法,2、化学法,1、加热法,3、辐射法,4、过滤法,（三）灭菌的矛盾之处,对杀灭细菌的同时1、培养基中的营养成份也随之遭到分解和破坏。2、杀死杂菌的同时也杀死
23、了工程细菌。,（四）具体的灭菌技术,可分为6种技术：1、间歇灭菌法2、加热灭菌法3、连续灭菌法4、空气加热灭菌法5、空气过滤灭菌法6、营养物质瞬时高温杀菌法,1：间歇灭菌法,又称为分批灭菌，是指将培养基放在发酵罐内，然后连罐加热到规定的灭菌温度。（1）灭菌方法（2）注意事项（3）间歇灭菌法的优点,（1）灭菌方法,间歇灭菌的操作过程分为3个过程：加热-保温维持-冷却。这些不同的阶段，均能够起到灭菌的作用。然而，在灭菌过程中，保温杀菌的作用是主要的，冷却杀菌的作用最小。,（2）注意事项,应当避免过长的加热时间，否则常常会破坏培养基中的营养物质。系统经过灭菌操作之后，必须达到不留1个杂菌，否则，只要
24、经过1昼夜的增殖，1个杂菌就会增加到272个杂菌，最后会导致整批发酵液的失败。,（3）间歇灭菌法的优点,设备造价低廉。便于进行手动操作。,2：加热灭菌法,隧道灭菌箱设备,3：连续灭菌法,（1）定义（2）技术分类（3）连续灭菌法的优点（4）连续灭菌法的不足,（1）定义,连续灭菌法是指灭菌的操作的加热、保温维持、冷却这三个过程，在同一时间内进行。因此，在连续灭菌系统中，需要分别设置加热设备、保温维持设备、冷却设备。,（2）技术分类,连续灭菌法可以分为2种：（1）加热、冷却缓慢交替进行方法。（2）迅速升温+闪急冷却方法-这种方法称为HTST方法，这对于保证营养物质极为有利。,（3）连续灭菌法的优点,
25、（1）可减少培养剂中营养物质的损失、提高产物收率。（2）由于操作条件恒定，可以获得稳定的灭菌质量。（3）容易实现自控操作。（4）能够避免系统的反复加热和冷却，可提高热利用率。是目前很多制药厂经常采用的方法。,（4）连续灭菌法的不足,（1）投资较大，（2）需要同时设置加热、冷却装置。,4：空气加热灭菌法,利用空气压缩时产生的高温，使得微生物体内的蛋白质变性，而达到杀菌目的，这种方法称为空气加热灭菌法。不同温度下的空气细菌存活时间：200/15.1s，250/5.1s，300/2.1s，350/1.05s。干热杀菌的流程通常是：先采用废热，将空气预热到60-70，然后进入压缩机压缩，并在200以上
26、的温度维持一段时间。以便杀死杂菌，然后再进入发酵罐之中。,5：空气过滤灭菌法,是指让空气通过过滤介质，以阻截空气中所含的微生物，取得无菌空气的目的。空气过滤分为2种：（1）绝对过滤（2）深层过滤,陶瓷过滤机,（1）绝对过滤,如超滤膜过滤就属于绝对过滤是指所用滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。从而把颗粒截留。,（2）深层过滤,是凭借滤层内的曲折通道，而将颗粒截留的方法。它不要求滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。这是目前发酵工业常用的过滤除菌方法。深层过滤所用的过滤介质-棉花、活性碳、玻璃纤维、合成纤维、各种有机或无机的烧结材料（烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料、蒙乃尔合金粉烧结板）、超细玻璃纤维、超细玻
27、璃纤维过滤纸，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA过滤板、PVA烧结板等已经在日本的发酵工业中广泛应用）。,6：营养物质瞬时高温杀菌法,一般来说，当温度升高时，微生物死亡速率的增加营养物质遭到破坏的速率。因此，对于瞬时的高温，细菌常常被杀死，而营养物质则破坏得不多。根据这一原理，可以采用营养物质瞬时高温杀菌法进行杀菌操作。,八：分离纯化技术,微生物的发酵产物是一种混合物，里面除了含有主要产物以外，还含有未能转化的基质和底物、残余的原料、大量的水、微生物细胞、各种杂质。因此，必须对发酵产物进行分离和纯化。分离和纯化过程被称作“下游加工过程”，需要经过以下这几个阶段：（一）固体物质的去除，（二）初步分离，（
28、三）产品提纯，（四）产品的最终分离。,（一）固体物质的去除,1、目的2、常用的方法有3、常用的设备4、固体物质的前期预处理技术,1、目的,（1）分离出完整的细胞。（2）将细胞进行溶菌处理，提取细胞内的生物产品。（3）除去细胞有残留碎片。（4）除去没有转化的不溶性基质。（5）一部分细胞返回到反应器内，进行再循环操作。,2、常用的方法,（1）过滤法-分批过滤、连续真空过滤、错流流动过滤。错流流动过滤法-使液体平等于过滤膜的表面进行流动，这样能够不断地移去在滤膜表面积累的细胞物质，从而获得近似于恒定的过滤速率。（2）离心分离法-垂直式离心、水平式离心。（3）沉降法-与一般的自由沉降不同，工业生产过程
29、的沉降都属于干扰式沉降。,3、常用的设备,（1）过滤设备-板框过滤机、回转真空过滤机（2）离心设备-转篮式离心过滤机（三足式离心过滤机）、刮刀卸料式离心过滤机、沉降式离心过滤机、喷雾离心过滤机、间断排料式离心过滤机、倾析式离心过滤机。（3）沉降设备-管式离心沉降机。,不锈钢板框压滤机,澄清型管式分离机,SSC600-NG三足式沉降离心机,19XKZ全自动压滤机,4、固体物质的前期预处理技术,由于生物反应液的粘度很大，直接分离往往比较困难，因此，常常对其进行预先的前期处理，来提高分离效果。常见的预处理技术有：（1）使细胞老化凝聚成团，（2）加热，（3）改变PH值，（4）添加化学物质促进凝聚，如加
30、入高分子电解质、氯化钙、胶态粘士。,（二）初步分离,进一步把已经分离的溶液浓缩，提高目的产物浓度的方法，称为初步分离。初步分离的具体方法可以分为：1、蒸发2、萃取3、沉淀4、膜分离,1、蒸发,蒸发是通过加热，使溶液中的水经过汽化除去要提高溶质浓度、为溶质的析出创造条件的一种操作方法。各种代谢物，如氨基酸、抗生素、酶都可以进行蒸发操作。由于生物产品大多数是热敏性物质，所以物料在蒸发器内的停留时间必须尽可能短，同时，还应该昼避免局部液体过热。,LG系列离心式刮板薄膜蒸发器示意图,蒸发设备（1）连续流动膜式蒸发器，（2）长管膜式蒸发器，（3）强制膜式蒸发器，（4）离心膜蒸发器。,2、萃取,萃取是通过
31、物质在2种溶液之间不同的溶解度，来实现分离的操作方法。萃取的分类（1）有机溶剂萃取（2）双水相萃取,（1）有机溶剂萃取,许多抗生素都能够溶解在有机溶剂之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通过萃取，可使得抗生素从水相进入有机相之中，从而实现分离。由于抗生素在有机溶剂之中极不稳定，因此，在保证萃取效率的前提条件下，必须尽量缩短操作时间。有机溶剂萃取设备可使用Podbielniak离心萃取机。,SFT-150超临界萃取反应仪,利用萃取法来提取抗生素，具有质量好、收率高、速度快的优点。双水相萃取法，目前用于进行酶、和蛋白质的提取工艺。,（2）双水相萃取,使用2种互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡
32、聚糖，分别将它们溶于水中形成双水相，利用目的产物在双水相中不同的分配系数而实现分离的方法，称为双水相萃取。萃取之后的目的产物可以通过超滤法进行提纯。双水相萃取材料-（1）PEG-葡聚糖萃取系统，（2）PEG磷酸钾萃取系统。,3、沉淀,蛋白质在溶液中具有“等电点”的特性，而且其等电点与溶液PH值有关，PH值大，蛋白质呈负电，PH值小，蛋白质呈正电，当PH=pI（等电点）时，蛋白质不带电荷。蛋白质在PI时的溶解度最小。这是因为蛋白质在水中有均匀分布是由于同性电荷相斥的缘故，当PH=pI时，由于蛋白质分子不带电荷，于是开始相互凝聚、产生沉淀。,NSG-630浓缩分离机,ZHN系列真空浓缩罐,沉淀和盐
33、折的结合,由于沉淀常常导致蛋白质变性而失效。而利用盐溶液就能避免蛋白质的变性，这种方法就称为-盐析法。在不同的盐溶液之中，蛋白质有盐析效应有所不同。按下列顺序递减：（1）阴离子-柠檬酸盐-3、酒石酸盐-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸盐-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。（2）阳离子-Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。从离子物性来看，硫酸铵并不是盐析效应最强的盐类，但是由于它在水中的溶解度极大，对盐析十分有利，因此硫酸铵是目前最常用的盐析剂。,4、膜分离,膜分离技术
34、是基于一种半透性薄膜，它能够使得溶液中的某些组分通过，而阻止和截留其它组分的分离方法。膜分离的优点（1）由于膜分离是纯粹物质粒度大小这一几何特性来进行分离，它不必象萃取、沉淀法那样需加入其它化学物质、也不必象蒸发那样进行加热。因此，产物的生物学特性能够得到完好的保存，（2）产物的损失量很少，有利于提高得率。膜分离的分类（1）反渗透法（2）超滤法,（1）反渗透法,根据物理化学的原理，当含有溶质A的溶液B与另一渗透液C之间被半透膜隔开的时候，由于系统渗透压的作用，渗透液C 便会进入到溶液B之中，这种现象称为渗透现象。形成这种渗透的压力就自然称为渗透压（）如果在溶液B一方施加压力（P），发现渗透液C
35、进入溶液B的速率就会减小。当压力（P）=渗透压（）时，渗透现象就会停止。当压力（P）渗透压（）时，就会看到溶液B开始反向进入渗透液C之中，这种现象就称为反渗透现象。根据溶液所具有的反渗透特性，可以实现溶液的浓缩。,（2）超滤法,是指在反渗透的基础之上，将隔离膜由原来的半透膜，改成带有较大孔径的薄膜。这样一来，在反渗透操作过程中，不但是溶剂进入到渗透液之中，就连那些许多小分子的杂质也连带一起进入到渗透液之中。与反渗透法相比，超滤法明显具有其优点-反渗透法只能起到浓缩作用，而超滤法在浓缩的同时，还具有纯化作用。,反渗透法+超滤法的实际应用,（1）主要用于蛋白质溶液的浓缩、脱盐等步骤，（2）在疫苗、
36、血浆等生产中也常被使用。膜分离装置的分类（1）中空纤维束，（2）板-框膜分离装置，（3）螺旋状膜分离装置,反渗透装置,（三）产品提纯,层析法，是指在一根层析柱内，填充某种特殊的载体物质，称为固定相。含有待分离产物的溶液则称为流动相。当流动相流过固定相的时候，由于流动相中不同的物质与固定相之间产生了不同强度的结合力，因此各种物质在层析柱内停留的时间也各不相同，结果，它们将依次序的先后流出层析柱。层析法的分类1、吸附层析法2、离子交换层析法3、凝胶层析法（分子筛）4、亲的层析法,1、吸附层析法,吸附层析法是利用各种物质与固定相之间由于吸附力的差异、而产生不同的结合力的原理，所进行的层析操作。固定相
37、对溶质产生结合力，这种结合力是以离子键、氢键、范德华力所产生的。而流动相的洗脱作用又对溶质和固定相之间产生脱离作用。这样，吸附脱离再吸附再脱离，导致溶质沿着洗脱液的方向移动。其移动速率取决于固定相对溶质的吸附能力，吸附力弱，移动就快，吸附力强，移动就慢。,2、离子交换层析法,（1）基本原理（2）离子交换过程（3）常用的离子交换树脂（4）离子交换层析法的应用,（1）基本原理,采用离子交换树脂作为固定相，离子交换树脂本身具有正离子基团和负离子基团，酸性电离基团可以交换阳离子，称为阳离子交换树脂。碱性电离基团可以交换阴离子，称为阴离子交换树脂。离子交换树脂同时具备极性基团和非极性基团。极性基团不断地
38、与溶液中的离子进行交换，而非极性基团则构成树脂分子的骨架，起支撑作用。,（2）离子交换过程,是一个同时包含吸附+吸收+穿透+扩散+离子交换+离子亲和，等等物理化学过程的综合作用的结果。,溶液中的溶质离子扩散到树脂的表面,溶质离子穿透树脂的表面,扩散到树脂颗粒的内部,溶质离子与树脂离子发生交换,树脂离子穿透树脂的表面,树脂离子扩散到溶液之中,（3）常用的离子交换树脂,（1）羧甲基纤维素阳离子交换树脂（CM-纤维素）-当阳离子蛋白质流经交换树脂时，由于静电吸引的作用，蛋白质将与树脂结合，然后用缓冲液进行冲洗交换柱，结合力最弱的蛋白质首先被洗脱下来。不同的缓冲液将各处洗脱“捡到”其中的某一蛋白质组分
39、。（2）二乙氨乙基纤维素阴离子交换树脂（DEAE-纤维素）-原理与CM-纤维素交换原理相同。,（4）离子交换层析法的应用,离子交换层析法具有收率高、质量好、周期短、成本低、设备简单、适合工业化生产等优点。目前已经普遍应用于生物化学制药行业。,离子交换柱,3、凝胶层析法,（1）基本原理（2）常用的凝胶层析材料（3）凝胶层析的应用价值,（1）基本原理,凝胶层析也称为凝胶过滤、分子筛层析、排阴层析、凝胶渗透层析等等。凝胶是一种具有多孔的、网状结构的分子筛。每一个颗粒就相当于一个筛子。当样品通过凝胶层析柱时，分子量较大的物质由于直径大于凝胶网孔，它们沿着凝胶颗料的间隙流动，因此速度较快而首先流出层析柱
40、。相反，分子量较小的物质可以自由地进出凝胶网孔，它们不断地在凝胶颗粒之中来回流动，从而导致进出速度下降。,（2）常用的凝胶层析材料,（1）葡聚糖凝胶，（2）聚丙烯酰胺凝胶。,AM90-1 型凝胶层析仪,（3）凝胶层析的应用价值,（1）可用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸等物质。能彻底分离分子量相差只有25%的二种蛋白质。（2）凝胶层析具有设备简单、分离迅速、不影响产物的分子生物学特性等优点。,4、亲和层析法,是利用生物分子之间所具有的专一亲和力而设计出的一种层析方法。（1）亲和层析的原理（2）亲和层析的例子,（1）亲和层析的原理,（1）载体活化-将载体在碱性条件下用溴化氢（CNB
41、r）进行活化。（2）通过偶联反应制成亲的吸附剂-将某一种能够与生物分子进行可逆性结合的物质（称作配基）通过偶联反应联结到载体上，（3）含有生物分子的样品通过层析柱。（4）生物分子与配基结合而被吸附，（5）未能进行特异性结合的其它杂蛋白，通过洗涤而流出层析柱。,（2）亲和层析的例子,层析目的-分离DNA解聚酶层析方法-以珠状的琼脂糖、或者聚丙烯酰胺作为载体，以DNA解聚酶的抑制物作为配基层析结果-（1）DNA解聚酶被特异性地结合在层析柱上，（2）其它物质全部流出（3）最后用适当的洗脱液通过层析柱，可获得纯度极高的DNA解聚酶,九：干燥技术,干燥操作往往是生物产品生产的最后一步，干燥的目的就在于除
42、去物料中的水分，便于保藏和运输。干燥注意事项-由于生物产品多数为热敏性物质，所以干燥过程必须注意使用那些干燥时间不太长、干燥温度不过高的设备。干燥技术和设备-（一）喷雾干燥（二）气流干燥（三）沸腾干燥（四）鼓式干燥（五）冷冻干燥,（一）喷雾干燥,喷雾干燥是利用不同的喷雾装置，如喷嘴、或者转盘，将浓缩液或者悬浮液喷成雾状，使它们形成具有极大表面积的分散液滴，在干燥室内缓缓沉降，并与热空气流发生强烈的热交换，在几秒到几十秒之内得到迅速干燥的方法。喷雾干燥由于干燥时间极短、避免了生物产品活性的破坏，适用于抗生素、酶制剂、热不稳定性蛋白质的干燥。,高速离心喷雾干燥机,（二）气流干燥,是利用颗粒在气流中
43、能够自由流动的特性，使物料与气流一起流经一段长的管道，颗粒物料在与气流一起流动的过程中，水分得到迅速汽化，因此，等到到达干燥管道出口处时，颗粒物料已经被干燥。,PG系列气流干燥机,（三）沸腾干燥,是利用流态化技术，被干燥物料由最上层逐层往下移动，而热空气则自下而上，与物料呈现逆向流动，在每层面上，使物料呈现出“沸腾状态。”称为沸腾干燥法。沸腾干燥的缺点-（1）干燥时间过短，则干燥不透。（2）干燥时间过长，则生物产品的活性遭到破坏。,GFG型高效沸腾干燥机,（四）鼓式干燥,这种干燥器有二个相向转动的鼓，鼓内通入热空气，当溶液被加入到鼓面上流动时，就得到了汽化。最后，干燥的物料由刮刀刮下。鼓式干燥
44、的应用范围-只能对那些热稳定性良好的药物进行干燥。,HZG型直接加热式回转滚筒干燥机,（五）冷冻干燥,1、基本原理2、冷冻干燥的程序3、冷冻干燥的应用4、冷冻干燥的设备,1、基本原理,又称升华干燥。将湿的物料在-50到-10之间冻结成固态，然后在高真空（1-0.001mmHg、1mmHg=133.332Pa）条件下，将其中的水分直接升华成气态，从而达到脱水、干燥的目的。,2、冷冻干燥的程序,（1）冻结-一般生物制品的共晶点在-20，因此，通常将制品冻结在-35到40之间。再维持12小时，以保证冻结完全彻底。（2）升华-在低温-30到-10之间，利用高真空度（13.330Pa）时，将溶剂变成气体
45、直接用真空泵抽走。通过升华过程，可驱除制品中90%的水分。（3）再干燥-将游离的冰晶升华完成之后，继续对制品进行加热，以驱除残余的水分。,3、冷冻干燥的应用,冷冻干燥法由于处理温度较低，对于热敏性物质的处理特别有利。适宜于抗生素、维生素的干燥。,SZG系列双锥回转真空干燥机,4、冷冻干燥的设备,（1）大规模生产设备由低温干燥箱+冷冻机+真空泵所构成。（2）小批量试制时可以在玻璃质冷冻干燥器中进行。将样品置于培养皿中，厚度不超过1cm，在冰箱中冻成硬块，再放入装有P2O5或者硅胶吸水剂的真空干燥器中，连续抽真空，来达到浓缩、干燥的目的。,第二节：利用微生物进行药物的生产实例,一：抗生素类二：氨基
46、酸类三：维生素类四：其它有机物与医药中间体,一：抗生素类,（一）、抗生素的分类（二）发酵法可以生产的种类（三）生产和制造实例,抗生素瓶洗烘灌塞生产联动线,（一）、抗生素的分类,按进行生产的微生物母体分（1）由细菌生产的抗生素-短杆菌肽，短杆菌肽S、杆菌肽、多粘菌素B。（2）由霉菌生产的抗生素-青霉素、灰黄霉素、甾酸菌素。（3）由放线菌生产的抗生素-链霉素、氯霉素、金霉素、四环素、红霉素、螺旋霉素、利福霉素、卡那霉素、交沙霉素、麦迪加霉素。,按化学结构分（1）-内酰胺类抗生素-青霉素类、头孢菌素类。（2）氨基糖苷类-链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素。（3）大环内酯类-红霉素、竹桃霉素、麦迪加霉
47、素、制霉菌素。（4）四环素类-土霉素、金霉素、四环素。（5）多肽类-杆菌肽、多粘菌素B,（二）发酵法可以生产的种类,（1）青霉素（2）头孢菌素（3）链霉素（4）卡那霉素（5）庆大霉素（6）红霉素（7）罗红霉素（8）麦迪霉素（9）乙酰螺旋霉素（10）四环素（11）土霉素（氧四环素）（12）金霉素（氯四环素）（13）林可霉素（14）多粘菌素（15）杆菌肽,（三）生产和制造实例,1、青霉素（在前面已经讲解）2、链霉素,2、链霉素,（1）生产准备（2）工艺流程（3）生产细则,（1）生产准备,生产用菌种-链霉菌、小单孢菌原始材料-氨基酸、酵母培养基-黄豆饼粉、糊精、淀粉、葡萄糖、碳酸钙、微量元素。,2工
48、艺流程,菌种斜面培养斜面种子摇瓶培养摇瓶种子种子罐培养2-3级种子培养液发酵罐培养发酵液过滤滤液阳离子交换树脂进行吸附交换饱和树脂洗脱洗脱液脱色、脱盐、浓缩成品浓缩液无菌过滤、干燥成品,（3）生产细则,（1）发酵温度25-28。（2）采用间隙补料、或者流加补料的工艺。（3）发酵5-7天。（4）板框过滤-离心分离-离子交换精制-喷雾干燥。,2：氨基酸类,（1）L-赖氨酸（2）L-苏氨酸（3）L-苯丙氨酸（4）L-异亮氨酸（5）L-亮氨酸（6）L-缬氨酸（7）L-组氨酸,3：维生素类,（1）VC（2）VA（3）VD2（4）VD3（5）VB1（6）VB2（7）VB12（8）VE,4：其它有机物与医药中间体,（1）柠檬酸（2）乳酸（3）葡萄糖酸（4）醋酸（5）乙醇（6）丙酮（7）甘油,
