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1、第十一章 生物素-亲合素放大技术,生物素（biotin,B）是一种小分子生长因子,又称维生素H或辅酶R动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高MW 244.31kD.,I环为咪唑酮环，可与亲合 素结合环为噻吩环，C2上戊酸 侧链的未端羧基是结合生 物大分子的唯一结构,I 咪唑酮环,噻吩环,羧基,第一节 生物素理化性质与标记,一、活化生物素,生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物活化生物素(生物素化衍生物),生物素活化,活化生物素易与抗原、抗体酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物,标记蛋白质氨基的活化生物素,标记蛋白质醛基的活化生物素,标记蛋白质巯基的活化生物素,标记核
2、酸的活化生物素,NH,NH,CH,CH2,CH,CH,O,S,(CH2)4COOH,NH2,O,CH2,CH2,O,NH,OH,O,O,N,O,O,C,CH2,CH2,EDC,标记蛋白质氨基的活化生物素,生物素,N-羟基丁二酰胺,碳二亚胺,生物素羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS）,活化生物素,BNHS分子可与蛋白质 赖氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质,如何减小空间位阻？长臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离,标记蛋白质醛基的活化生物素,生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物
3、 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接 后，再与无水肼反应而成。除醛基外，BCHZ还可标记氨基,标记蛋白质巯基的活化生物素,马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素,标记核酸的活化生物素,光敏生物素(photobiotin)侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后,变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成B-核酸探针,N3,NO2,NH,(CH2)3,N,(CH2)3,CH3,NH,C,(CH2)4,S,NH,NH,O,生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）作为TTP的结构类似物，可采用缺口移 位法掺入到双链DNA中。,B
4、NHS和BHZ 可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。,二、生物素标记蛋白质,活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性；对BNHS多标记抗体,BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后 活性将降低；,选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1,IgG应用浓度 0.55g/ml;生物素13个/Ag，35个/Ab；使用交联臂减少空间阻力,第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记,亲合素(avidin
5、,AV)和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。,结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基PI 10.5 6结合位 色氨酸 色氨酸生物素 4 4Ka 1015 1015活性 1315 1518,亲合素（A）,链霉亲合素(SA),一、理 化 特 性,二、亲合素/链霉亲合素标记,标记物：小分子示踪物125I、胶体金、荧光素、化学发光物 大分子物质如酶抗原、抗体亲和素的标记：HRP的标记 改良过碘酸钠法 戊二醛法,过碘酸盐氧化法,NaIO4,O,O,OH,+NH2Avi
6、din,O,O,O,N,N,Avidin,Avidin,H2O,N,Avdin,NaBH4,Schiff碱,酶-五炭糖环,戊二醛法,酶NH2亲和素NH2,(CH2)3,C,H,O,C,H,O,(CH2)3,CH,N,酶,CH,N,亲和素,B-E+A ABC,2.亲和素生物素化HRP复合物的制备,链霉亲和素的标记方法：过碘酸钠法HRP+NaIO4+SA 透析+KBH4 沉淀,过碘酸盐氧化法,NaIO4,O,O,OH,+NH2SAvidin,O,O,O,N,N,SAvidin,SAvidin,H2O,N,Avdin,KBH4,Schiff碱,酶-五炭糖环,第三节 生物素-亲合素系统的特点,一、灵敏
7、度高二、特异性强三、稳定性好四、适用性广五、其他,第四节 生物素-亲合素系统的应用,生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。,一、生物素-亲合素系统基本类型及原理,BAB法：Ag+BAb Ag-AbB A Ag-AbB-A BE Ag-AbB-A-BE 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E,+A,+A,ABC法 A+BE A-BE-ABC Ag+BAb Ag-AbB ABC Ag-AbB-ABC 特点:将B
8、AB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC,+,+ABC,B-E+A ABC,Ab-Ag-Ab-B+ABC Ab-Ag-Ab-B-ABC,BA法Ag+BAb Ag-AbB AE Ag-AbB-AE特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省 却了加B-E的步骤,Ag-Ab1-Ab2-B+A-E Ag-Ab1-Ab2-B-A-E,+A-E,BAS实验方法及反应层次,二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用,BAS在ELISA中的应用 生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定,A,B,固相化抗原或抗体,B,Y,电化学发光免疫测定示意图,用于终反应的放大,三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应
9、用,BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法。,四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用,BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离,五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用,以生物素标记核酸探针进行的定位检测用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的
10、检测,Anti-HCV,Sandwich principle.Total duration:18minutes.1st incubation:40L of sample,60 L of reagent containing biotinylated HCV antigens and 60 L of a reagent containing HCV antigens labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich complex.2nd incubation:After addition of strepetavidin-coa
11、ted microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biontin and streptavidin.,The reaction mixture is aspirated into the measuring cell where the microparticles are magnetically captured onto the surface of the electrode.Unbound substances are then removed with ProCell
12、.Application of a voltage to the electrode then induces chemiluminescent emission which is measured by a photomultiplier.Results are determined automatically by the Elecsys software by comparing the electrochemiluminescence signal obtained from the sample with the cutoff value obtained by anti-HCV c
13、alibration.,HBsAgII,Sandwich principle.Total duration of assay:18 minutes.1st incubation:50 L of sample,two biotinylated monoclonal anti-HBsAg antibodies,and a mixture of monoclonal anti-HBsAg antibody and polyclonal anti-HBsAg antibodies labeled with a ruthenium complex form a sandwich complex.2nd:
14、incubation:After addition of streptavidin-coated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.,Anti-HBe,Competition principle.1st:incubation:Anti-HBe in the sample(35 L)binds to the added HBeAg.2nd incubation:After addition of biotinylated an
15、tibodies and ruthenium complex-labeled antibodies specific for HBeAg,together with streptavdin-coated microparticles,the still-free binding sites on the HBe-antigens become occupied.The entire complex is then bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavdin.,Anti-HAV IgM,-Capture t
16、est principle.Total duration of assay:18 minutes.1st incubation:Pretreatment of 10 L of the automatically 1:400 diluted sample(using Elecsys Diluent Universal)with anti-Fdy reagent to block specific in the presence of the monoclonal anti-HAV antibodies labeled with ruthenium complex.,2nd incubation:
17、After addion of biotinylated monoclonal h-IgM-specific antibodies,HAV antigen,and streptavdin-coated microparticles,the anti-HAV IgM antibodies present in the sample form a sandwich complex with the HAV antigen and the ruthenium-labeled anti-HAVantibody which becomes bound to the solid phase via int
18、eraction of biotin and streptavidin.,Anti-HBs,Sandwich principle.1st incubation:Anti-HBs in the sample(40L),biotinylated HBsAg(ad/ay),and HBsAg(ad/ay)labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich coplex.2nd incubation:After addition of strepavdin-coated microparticles,the comples becomes
19、 bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.,小 结,生物素亲合素（链霉亲合素）系统具有的多级放大独特效应，可极大地提高分析测定的灵敏度；二者之间的高亲和、高特异结合以及既可偶联生物大分子，又可连接标记材料的特性，使该系统在标记免疫分析技术领域中的应用具有很强的稳定性和适用性。该系统有二种基本类型：以游离亲合素为中间物，分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素的BAB法或ABC技术；另一类是直接用标记亲合素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法或LAB。,重点,名词解释：活化生物素1.
20、活化生物素种类2.生物素的结构特点，亲和素特点3.生物素亲和素系统基本类型及原理,选择题,若形成Ag生物素化Ab亲和素 酶标生物素复合物，采用的是哪种BASA.LAB法B.ABC法C.BA法D.BAB法E.RBA法,BAB法BAS放大系统应用于间接法ELISA时，以下哪一种成分被生物素化A.抗原B.第二抗体C.抗原特异抗体D.固相抗体E.HRP,直接法BAB的反应模式为A.Ag（AbB）A*B.Ag（AbB）AB*C.Ag（AbB）AB*CD.AgAb1（Ab2B）A*E.Ag（AbA）B*,可与蛋白质氨基结合的活化生物素是A.生物素羟基丁二酰胺酯（BNHS）B.光敏生物素C.生物素酰肼（BHZ）D.马来酰亚胺丙酰生物胞素（MPB）E.Bio-11-dUTP,
